關鍵詞:基因甲基化檢測服務|實驗技術服務
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測序實驗流程：
DNA甲基化是*早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。
檢測程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化;反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，*后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導致熔解溫度的變化.
送樣要求
細胞(≥106 個)、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點與程度的實驗方法有三類：
（1）（M SREs）利用對甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點，從而產(chǎn)生片段差異，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點與甲基化程度，
（2）另一類是利用將沒有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質，而甲基化的C不會發(fā)生相應變化來識別甲基化位點。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測，Pyrosequencing技術是近年一種全新的技術，這項技術曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過峰值的高度可以**的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復性和**性。
 MSP 實驗流程：  
1.       基因組抽提；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉化（C轉化為U)，本步實驗至關重要，轉化效率高低直接影響實驗結果，所以，需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉化效率；
4.       引物設計（每個基因設計兩對引物，分別為：甲基化引物M，非基因化引物U，對應擴增甲基化和非甲基化的目的片段），有時需設計巢式引物；
5.       PCR 擴增：對甲基化和非甲基化的目的片段分別擴增,此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度；
6.       PCR 產(chǎn)物電泳；
7.       電泳結果分析（定性即有無甲基化，半定量即甲基化程度高低）。