關(guān)鍵詞:基因表達和慢病毒構(gòu)建包裝純化服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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基因表達和慢病毒構(gòu)建包裝純化服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0軟件進行序列對比分析和進化樹構(gòu)建。經(jīng)雙酶切將HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）質(zhì)粒中。結(jié)果；成功克隆了基因型C型突變型HBx基因，并構(gòu)建出真核表達載體pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登錄號為AY839630。序列對比和進化樹分析表明．新克隆的基因與野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的變異。
從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。目前發(fā)展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計特異引物，通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內(nèi)切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
奇妙的克隆克隆技術(shù)已展示出廣闊的應(yīng)用前景，概括起來大致有以下四個方面：
（1）培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實驗動物；
（2）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物；
（3）生產(chǎn)人胚胎干細胞用于細胞和組織替代療法；
（4）復(fù)制瀕危的動物物種，保存和傳播動物物種資源。
表達策略：1 反向遺傳學(xué)：克隆的CDS可以亞克隆到特定的表達載體，并轉(zhuǎn)基因到特定的物種（如果本物種的轉(zhuǎn)基因體系尚未建立或很困難，可以先轉(zhuǎn)入一些模式生物），按需要在各種啟動子的驅(qū)動下在生物體內(nèi)表達，觀察表型；同時可以根據(jù)該CDS序列，設(shè)計RNAi載體，轉(zhuǎn)基因，觀察表型。如果需要，可以克隆該基因本身的啟動子，然后讓其驅(qū)動該基因或RNAi片斷表達。
2 體外表達：可以利用大腸桿菌、酵母系統(tǒng)，在體外做一些原核或真核的表達。用以研究酶活，制備抗體等。
基因克隆過程:１、 獲得待克隆的DNA段（基因）；
２、 目的基因與載體在體外連接；
３、 重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；
４、 篩選、鑒定陽性重組子；
５、 重組子的擴增與／或表達。
材料與方法
1.1　動物和細胞　BALB/c小鼠均為雌性, 5～8周齡,由本校動物中心提 供;小鼠骨髓瘤細胞SP2/0株(H-2d)和人肝癌細胞7721株由本室保存。
1.2　質(zhì)粒和細菌　pBRTMHCV1-3011質(zhì)粒［包含除5'非編碼區(qū)基因(NCR) 外全部HCV基因序列］,由美國Rice教授惠贈;pcDNA3真核表達載體和大腸桿菌菌種JM109由 本室保存;質(zhì)粒制備、含HCV C基因的真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建見文獻［2］。
1.3　主要試劑及工具酶　 HCV C抗原由**醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所凌世淦教 授惠贈;脂質(zhì)體(Lipofectamine)、酶標抗體及限制性內(nèi)切酶、連接酶等均購自華美生物公司 。
1.4　細胞表達產(chǎn)物的鑒定　將重組質(zhì)粒pcDNAHCV-C用Lipofectamine 轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染SP2/0細胞和7721細胞,72 h后收集細胞。SP2/0細胞涂片,以HCV C單抗為 一抗做免疫熒光檢測;7721細胞用超聲斷裂后,收集細胞懸液及上清,煮沸10 min,也以HC V C單抗為一抗,Western blot法檢測表達的蛋白。
1.5　小鼠免疫及血清抗體水平測定　重組質(zhì)粒大量提取,PEG純化。48 只BALB/c小鼠股四頭肌注射 0.25%布比卡因100 μl,24 h后分兩組,在同一部位肌肉接種質(zhì) 粒。第1組注射100 μg重組質(zhì)粒pcDNAHCV-C或空載體對照pcDNA3,2 w后,將實驗鼠再分成 兩部分,一部分按以上方法每間隔2 w再次接種同量的DNA,共注射5次,另一部分不再接種; 第2組注射不同劑量50～200 μg的質(zhì)粒DNA。不同劑量或不同注射次數(shù)組均設(shè)4只復(fù)鼠,小鼠 每次接種前24 h均需用0.25%布 比卡因100 μl預(yù)處理,兩組均每間隔2 w剪尾取血。鼠血清1:50稀釋后,ELISA法檢測HCV C 特異性抗體產(chǎn)生情況。