關(guān)鍵詞:TUNEL檢測(cè)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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TUNEL檢測(cè)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：TUNEL檢測(cè)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
器材與試劑
1、器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。
2、試劑：試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標(biāo)記的dUTP、標(biāo)記streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；
自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；
（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）。
（9）另外，雙蒸水、無(wú)菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、蘇木素。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次；
2、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min）；
3、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min；
4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min；
5、浸洗：PBS 5 min×2次；
6、細(xì)胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30） min RT；
7、浸洗：PBS洗5 min；
8、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min；
9、浸洗：PBS 5 min×2次；
10、平衡：加100 ul平衡液，濕盒平衡10（5~10） min；
11、制備TUNEL反應(yīng)混合液：處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標(biāo)記的dUTP+98 ul平衡液混勻；而陰性對(duì)照組不加rTdT，改為三蒸水；陽(yáng)性對(duì)照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min，后面步驟從第10步開始。
12、標(biāo)記反應(yīng)：加100ul TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h。
13、終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 min；
14、浸洗：PBS 5 min×3次；
15、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min；
16、浸洗：PBS 5 min×3次；
17、酶標(biāo)反應(yīng)：加100 ul streptavidin標(biāo)記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min；
18、浸洗：PBS 5 min×3次；
19、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時(shí)。
20、用去離子水沖洗幾次；
21、用蘇木素復(fù)染，3 s左右后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水（50、70、85、95、100、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。
22、加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。
注意事項(xiàng):
1、結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
2、初次檢測(cè)細(xì)胞凋亡，*好設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照片。
3、血細(xì)胞含量高的組織，盡可能延長(zhǎng)過(guò)氧化氫的滅活時(shí)間。
4、蘇木素的復(fù)染時(shí)間需要摸索。
5、每片所加試劑可調(diào)整，一般30~100 ul不等，但也要防止液體揮發(fā)而干片，且反應(yīng)均在放置濕盒內(nèi)。