關鍵詞:Transwell實驗技術服務|實驗技術服務
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Transwell實驗技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產品品牌：Transwell實驗技術服務|實驗技術服務   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
檢測穿過的細胞數有兩種方法：
1 ) 直接計數法
“貼壁”細胞計數:
 “貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。 通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞
A. 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. 染色：常用的0.1%結晶紫染色。
優(yōu)點：(1) 不需固定細胞，直接染色即可。
(2) 配制簡單方便。
(3) 可以用33%醋酸脫色，測量洗脫液OD570值，間接反映細胞數
注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。
C. 細胞計數：
(1) 顯微鏡進行觀察和拍照
(2) 取3-5個視野計數細胞個數
2) 間接計數法
用于穿過細胞過多，而無法通過計數獲得準確的細胞數。
MTT法
A. 棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. 24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室浸沒于其中，置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500μl DMSO，將小室浸沒于其中，振蕩結晶充分溶解。
D. 取出小室，測所得DMSO的OD值。
結晶紫檢測
A. 棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. （可選）甲醛固定30分鐘，室溫
B. 24孔板中加入500μl  0.1%結晶紫溶液，將小室浸沒于其中，室溫放置20分鐘
C. 24孔板中加入500μl 33%醋酸，將小室浸沒于其中，脫色。
D. 取出小室，測量洗脫液OD570值。
優(yōu)點：染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。
一、腫瘤細胞侵襲實驗（transwell）
原理：
模仿體內細胞外基質，細胞只有分泌基質金屬蛋白酶（MMPs），降解基質膠才可進入下室。
步驟
1.  Transwell小室準備
1）無基質膠Transwell小室制備
A. 包被基底膜：
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀釋，無血清培養(yǎng)基作為稀釋液
B. 取適量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul)，4℃操作。
C. 37℃培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（>5h）；出現(xiàn)“白色層”時，說明已經變?yōu)楣虘B(tài)。
2）有基質膠Transwell小室制備
A. 小室放入培養(yǎng)板中，上室加入300μl預溫的無血清培養(yǎng)基
B. 室溫下靜置15－30min，使基質膠再水化
C. 再吸去剩余培養(yǎng)液。
2．細胞懸液準備
1）消化、收集細胞；
2）PBS洗1－2次
3）用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸（細胞密度約在1－10×105/ml）。
3. 細胞接種
1）取適量細胞懸液加入Transwell小室（按transwell說明）。24孔板小室一般200μl。
2）24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。注意避免氣泡產生（下層培養(yǎng)液和小室間）
3） 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。
4. 結果統(tǒng)計