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IP和Co-IP技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；（2）確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔；（3）分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
具體操作：
收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°c， *大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；
取少量裂解液以備western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°c緩慢搖晃孵育；
取10μl protein a 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；
將預(yù)處理過(guò)的10μl protein a 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育的細(xì)胞裂解液中4°c緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein a瓊脂糖珠偶連；
免疫沉淀反應(yīng)后，在4°c 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；*后加入15μl的2×sds 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
sds-page, western blotting或質(zhì)譜儀分析。
注意事項(xiàng)
(1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。
(2)使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用
(3)使用對(duì)照抗體：
單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗
兔多克隆抗體：正常兔IgG
在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
(2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；
(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。