關(guān)鍵詞:cDNA文庫構(gòu)建/EST測序分析|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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cDNA文庫構(gòu)建/EST測序分析|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：cDNA文庫構(gòu)建/EST測序分析|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒?yàn)流程：
1、mRNA在無細(xì)胞翻譯體系指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(Cell-free translation system)，又叫體外轉(zhuǎn)錄-翻譯的偶聯(lián)系統(tǒng),因?yàn)樵撓到y(tǒng)需要制備無細(xì)胞提取物,還有人稱之為"溶胞粗制品翻譯系統(tǒng)"。
無細(xì)胞提取物的制備:
用機(jī)械的,超聲波的,滲透壓或用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┑确椒?將細(xì)胞溶破,再高速離心出去其質(zhì)膜與細(xì)胞核等.該提取液中含有RNA聚合酶,核糖體,tRNA和能量發(fā)生系統(tǒng).
常見的體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng):
兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)。網(wǎng)織紅細(xì)胞無細(xì)胞核,其合成的蛋白質(zhì)90%以上為珠蛋白.
缺 點(diǎn):已含有珠蛋白mRNA.可以在該體系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去體系中的珠蛋白mRNA 。
麥胚系統(tǒng)用組織搗碎機(jī)將麥子搗碎,分離出麥胚.然后將粗制的麥胚加10倍體積的緩沖液與砂子共研磨.23000g離心所得的上清夜稱為S23 ;將S23分裝,保存于-20°C冰箱中.
利用麥胚系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯合成研究時(shí),需加的物質(zhì)與網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)相似.由于該體系無mRNA,所以必須加入mRNA。
優(yōu) 點(diǎn):適于研究mRNA,活力強(qiáng),價(jià)格低廉等.
缺 點(diǎn):不同制品的活性差別較大,且合成分子量較大(71X105 Dal)的蛋白質(zhì)時(shí)往往提前終止.
哺乳動(dòng)物mRNA在紅細(xì)胞裂解液中翻譯
2、mRNA在無細(xì)胞體系中指導(dǎo)合成目的多肽的能力
3、mRNA分子的大小
哺乳動(dòng)物mRNA長度為500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間.
4、總mRNA指導(dǎo)合成cDNA**鏈長分子的能力
利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA
磁珠法分離mRN
1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的總RNA和RNase-free水至終體積為500ul.
2. 65ºC加熱10分鐘。
3. 加入3ul生物素標(biāo)記的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷去至室溫，一般需10 分鐘左右。
4. 同時(shí)配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.
5. 將磁珠(SA-PMPs)輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側(cè)(約30sec)，小心去上清，切不可離心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重復(fù)3次。
6. 將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs應(yīng)在30分鐘內(nèi)使用。
7. 將(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反應(yīng)物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10 分鐘。
8. 用磁性分離架捕獲SA-PMPs,小心去上清，但不要棄去。
9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，*后一次漂洗后盡可能多的吸取水相，而不損壞SA-PMPs.
10.將SA-PMPs重新懸浮在0.1ml RNase-free水中，反復(fù)顛倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。
11.用磁性分離架捕獲SA-PMPs,將洗脫的mRNA吸入另一個(gè)新的Eppendorf管中。
12.將SA-PMPs再懸浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脫，與(11)步洗脫液合并。
13.將得到的mRNA溶液取幾微升跑電泳，若mRNA濃度不足以進(jìn)行下一步的反轉(zhuǎn)錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮(濃縮步驟見14-18)。
14.加0.1體積的3mol/l NaAc和1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-20ºC沉淀。
15.4ºC，13000g離心60 分鐘。去上清，加入500ul 70%乙醇混勻。
16.4ºC，7500g離心10 分鐘。
17.去上清，真空或空氣中自然風(fēng)干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。
18.重復(fù)步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱
注意事項(xiàng):
1.所有操作均需要嚴(yán)格戴手套，戴口罩進(jìn)行
2.如果total RNA質(zhì)量高，雜質(zhì)少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。
3.mRNA的電泳圖是smear。