關(guān)鍵詞:454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
實(shí)驗(yàn)描述               
GS FLX系統(tǒng)的工作流程
GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來，就是“一個(gè)片段 = 一個(gè)磁珠 = 一條讀長（One fragment = One bead = One read）”。
1）樣品輸入并片段化：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。
2）文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測序步驟。變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA），具有A、B接頭的單鏈DNA段組成了樣品文庫。
3）一個(gè)DNA段＝一個(gè)磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA段。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。
4）乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。
5）一個(gè)磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入“Pico TiterPlate”（PTP）板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，*終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號。此反應(yīng)釋放出的光信號實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD相機(jī)捕獲到。有一個(gè)堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。
6）數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個(gè)讀長，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400 MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。
GS FLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。由于沒有終止元件來阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度就需要從信號強(qiáng)度中推斷出來。這個(gè)過程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測序平臺的主要錯(cuò)誤類型是插入-缺失，而不是替換。