關(guān)鍵詞:總RNA提取服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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總RNA提取服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
（一）細(xì)胞總RNA的提取 
1、6孔板細(xì)胞匯合度為90-100%時(shí)，取出無(wú)菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑 1 ml，搖勻，無(wú)菌罩內(nèi)消化3-5 min。
2、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過(guò)的1.5 ml EP管中，加新開(kāi)的氯仿0.2 ml，輕搖15 s。
3、室溫靜置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，離心。然后取上清無(wú)色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過(guò)），加0.5 ml新開(kāi)的異丙醇，室溫下靜置10 min。
4、12000 rpm，10 min，4 ℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清，75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃離心。
5、去上清，點(diǎn)離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10 min， DEPC處理水20-30 μl加入，中槍打勻，55-60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測(cè)OD值。
6、電泳。
（二）從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個(gè)新的無(wú)RNase 的EP管中，用無(wú)RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打勻或用手彈勻。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)）。
4、20-30℃條件下，靜置10 min（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。
5、高速離心2 min，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1 min。
7、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速離心1 min，丟掉濾過(guò)液。
8、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加20-100 μl熱的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來(lái)回吸打3-4 次，高速離心1 min。
10、電泳。
9、為保證*大的 mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第8步。
1. 六孔板每孔細(xì)胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，槍頭吹打。
2.  將各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。15－30℃下孵育2-3min，離心（4℃，12,000g，15min）。
3.  離心后液體分為三層（上層－無(wú)色水樣層為RNA，中層白色為DNA和底層紅色為蛋白質(zhì)），小心吸取上層無(wú)色液體移入一新的EP管中。
4. 加入等體積異丙醇，0.4－0.5ml，混勻，15-30℃下孵育10－30min，離心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等體積異丙醇后，置于試管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。
5. 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩渦振蕩30s，離心（4℃，7,500g，5min）。
6.  小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺(tái)中鼓風(fēng)靜置干燥3-5min。*好是用槍頭吸取上清，盡量除去。
7. 加入20ul DEPC水溶解，分裝5ul/管，-70℃冰箱保存。
8. 細(xì)胞總RNA的鑒定：0.9-1.2％瓊脂糖電泳鑒定細(xì)胞總RNA，觀察出現(xiàn)條帶及各條帶亮度。紫外分光光度計(jì)測(cè)定：分別測(cè)定細(xì)胞總RNA在260nm和280nm處的光密度值(OD)，并計(jì)算RNA的含量和純度。