關(guān)鍵詞:總RNA提取技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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總RNA提取技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> （一）細(xì)胞總RNA的提取 
1、6孔板細(xì)胞匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑 1 ml，搖勻，無菌罩內(nèi)消化3-5 min。
2、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中，加新開的氯仿0.2 ml，輕搖15 s。
3、室溫靜置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，離心。然后取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10 min。
4、12000 rpm，10 min，4 ℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清，75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃離心。
5、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10 min， DEPC處理水20-30 μl加入，中槍打勻，55-60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測OD值。
6、電泳。
（二）從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打勻或用手彈勻。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二級結(jié)構(gòu)）。
4、20-30℃條件下，靜置10 min（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。
5、高速離心2 min，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1 min。
7、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速離心1 min，丟掉濾過液。
8、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 μl熱的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4 次，高速離心1 min。
9、為保證*大的 mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第8步。
10、電泳。
操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12-24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100μl 吸頭挑出，涼干，用200μlTE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行。）
3.加等量的酚，氯仿，異戊醇（25:24:1）、振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿，異戊醇（24：1），振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ，10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。