關(guān)鍵詞:原核表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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原核表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)方案 
1.  外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
（1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
（2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。
（3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性?xún)?nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測(cè)定，確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步。
（4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h ；如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h 。
(5 ）取上述培養(yǎng)液1 ml，1 000 g 離心，1 min，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測(cè)。
2.  大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化
（1 ）細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。
a.  酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類(lèi)有作用，而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著。
主要步驟為：
① 4 ℃ ，5 000 rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 ml ）。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液，懸浮沉淀。
② 每克菌加8 μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。
③ 37 ℃ ，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20μL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。
b.  超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA 進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。
① 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ℃ ，5 000 rpm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。
② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10 000 g 離心，15 min ，分別收集上清液和沉淀。
③ 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS -PAGE 。
注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類(lèi)型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。