關(guān)鍵詞:原核表達(dá)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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原核表達(dá)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：
（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；
（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；
（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn))；
（4）一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭；
（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。
原核表達(dá)一般程序如下：
獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測(cè)序驗(yàn)證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)
一、試劑準(zhǔn)備
1、LB培養(yǎng)基。
2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。
二、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA**鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
（四）誘導(dǎo)表
1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 ≌0.4-1.0（*好0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻，70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。
三、注意事項(xiàng)
1、選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的*終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。
2、融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。