關(guān)鍵詞:單克隆抗體制備技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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單克隆抗體制備技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：單克隆抗體制備技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒?yàn)流程：
其原理是: B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體， 但在體外不能進(jìn)行無限分裂; 而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代， 但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。
一.提取合成專一性抗體的單個B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。
二.應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性
三.對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，選出所需要的細(xì)胞群，體外或體內(nèi)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液或動物腹水中提取單克隆抗體
單克隆抗體的提純
一般常用金黃色葡萄球菌蛋白A-瓊脂糖4B親和層析法。
單克隆抗體的保存 由腹水中獲得的抗體,經(jīng)離心去除細(xì)胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心,取上清液加0.1%NaN3，少量分裝，冷凍于-70℃可保存幾年。 但應(yīng)避免反復(fù)凍融,否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體,冷凍干燥保存于2~8℃，取出時溶解后，保存于2~8℃，至少一個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4℃)保存兩年，融化后放置4℃下保存一個月。短期使用的腹水抗體，4℃3~4 個月仍保持穩(wěn)定, 培養(yǎng)上清加0.1%NaN3，貯于-20℃，兩年不失活性。
特點(diǎn):
一是特異性，針對特定的單一抗原表位，它具有高度的特異性，抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷靶細(xì)胞、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強(qiáng)的療效。
二是多樣性，主要表現(xiàn)在靶抗原的多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性、作用機(jī)制的多樣性等方面。
三是定向性，抗體藥物可以定向制造，就是根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體藥物。
1 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
選擇生長狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞，覆蓋瓶底80％時棄上清，以不完全培養(yǎng)基洗滌一次后，用l0 mL不完全培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹下。
2 脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備
取加強(qiáng)免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫臼將小鼠致死，用75%酒精消毒體表10 min，隨即放入超凈臺內(nèi)的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；無菌打開腹腔取出脾臟，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌，并仔細(xì)去掉周圍附著的結(jié)締組織；隨后將脾臟轉(zhuǎn)移到另一個盛有DMEM的平皿中。用研磨棒擠壓，使脾細(xì)胞充分釋放，制成脾細(xì)胞懸液。
3 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作為陰性血清，頸脫臼處死；體表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0 mL注射器，12#針頭，吸取10 mL HAT培養(yǎng)基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內(nèi)液體，注入己準(zhǔn)備好的容器中。
4 融合
將上述制備的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合于一支50 mL的帶蓋的融合管中，1000 rpm離心10 min，棄上清。將融合管置于手掌中，輕輕摩擦底部，使兩種細(xì)胞充分混勻；在37°C水浴中45 s內(nèi)緩慢加入1 mL預(yù)熱的PEG-1500到融合管中，邊加邊輕輕搖勻；隨即在90 s內(nèi)先慢后快滴加30 mL 37°C預(yù)熱的不完全DMEM培養(yǎng)基，使PEG稀釋而失去作用，37°C靜置10 min，1000 rpm離心10 min；棄上清，用60 mL HAT培養(yǎng)基輕輕懸浮沉淀細(xì)胞，再加入適量的腹腔巨噬細(xì)胞；分裝于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將培養(yǎng)板置37°C 6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5 d后用新鮮的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基；10 d后用預(yù)熱的HT換出HAT；觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其細(xì)胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取適量細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測,兩次檢測結(jié)果為陽性設(shè)為陽性克隆孔。
雜交瘤細(xì)胞的克隆化及建株
采用有限稀釋法對連續(xù)兩次檢測為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行克隆化。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取100個細(xì)胞放入5 mL含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，即20個細(xì)胞/mL，100 μL/孔滴加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，即每孔1個細(xì)胞：再將余下的細(xì)胞懸液倍比稀釋，細(xì)胞數(shù)為10 個/mL，100 μL /孔滴加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，即每孔0.5個細(xì)胞。第8～9 d時，肉眼可見細(xì)胞克隆，對出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆的孔再按篩選陽性雜交瘤細(xì)胞的間接ELISA方法進(jìn)行篩選。連續(xù)進(jìn)行三次以上亞克隆，判為陽性的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，建株凍存。