關(guān)鍵詞:Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
檢測(cè)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：
1 ) 直接計(jì)數(shù)法
“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù):
 “貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。 通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞
A. 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. 染色：常用的0.1%結(jié)晶紫染色。
優(yōu)點(diǎn)：(1) 不需固定細(xì)胞，直接染色即可。
(2) 配制簡(jiǎn)單方便。
(3) 可以用33%醋酸脫色，測(cè)量洗脫液OD570值，間接反映細(xì)胞數(shù)
注意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會(huì)染不上。
C. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：
(1) 顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照
(2) 取3-5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)
2) 間接計(jì)數(shù)法
用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多，而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)。
MTT法
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. 24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室浸沒(méi)于其中，置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500μl DMSO，將小室浸沒(méi)于其中，振蕩結(jié)晶充分溶解。
D. 取出小室，測(cè)所得DMSO的OD值。
結(jié)晶紫檢測(cè)
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. （可選）甲醛固定30分鐘，室溫
B. 24孔板中加入500μl  0.1%結(jié)晶紫溶液，將小室浸沒(méi)于其中，室溫放置20分鐘
C. 24孔板中加入500μl 33%醋酸，將小室浸沒(méi)于其中，脫色。
D. 取出小室，測(cè)量洗脫液OD570值。
優(yōu)點(diǎn)：染色和脫色的過(guò)程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色。
一、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（transwell）
原理：
模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞只有分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解基質(zhì)膠才可進(jìn)入下室。
步驟
1.  Transwell小室準(zhǔn)備
1）無(wú)基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 包被基底膜：
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀釋?zhuān)瑹o(wú)血清培養(yǎng)基作為稀釋液
B. 取適量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul)，4℃操作。
C. 37℃培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（>5h）；出現(xiàn)“白色層”時(shí)，說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。
2）有基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 小室放入培養(yǎng)板中，上室加入300μl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基
B. 室溫下靜置15－30min，使基質(zhì)膠再水化
C. 再吸去剩余培養(yǎng)液。
2．細(xì)胞懸液準(zhǔn)備
1）消化、收集細(xì)胞；
2）PBS洗1－2次
3）用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸（細(xì)胞密度約在1－10×105/ml）。
3. 細(xì)胞接種
1）取適量細(xì)胞懸液加入Transwell小室（按transwell說(shuō)明）。24孔板小室一般200μl。
2）24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。注意避免氣泡產(chǎn)生（下層培養(yǎng)液和小室間）
3） 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。
4. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)
注意點(diǎn):
①Transwell小室：
注意是否是預(yù)先鋪好膠
② 上層培養(yǎng)液：
上層培養(yǎng)液采用無(wú)血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 細(xì)胞：
有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。
④ 基質(zhì)膠：
常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel
⑤ 下層培養(yǎng)液：
下層常用含5%－10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。
⑥ 細(xì)胞培養(yǎng)板：
細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買(mǎi)的Transwell小室相配套。