關鍵詞:Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實驗技術服務
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Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產(chǎn)品品牌：Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實驗技術服務   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗 體起免疫反應，再與酶或同位素標記的**抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋 白水平的表達。
1. 組織塊稱重 
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊 
3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA），PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron進一步勻漿（15,000轉/分*1分鐘）維持4℃ 
4. 加入PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分鐘 
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g（約15,000轉）15分鐘 
6. 上清液為細胞裂解液可分裝-20℃保存 
7. 進行Bradford比色法測定蛋白質濃度 
8. 取相同質量的細胞裂解液（體積*蛋白質濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液 
9. 沸水浴中3分鐘 
10. 上樣 
11. 電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA） 
12. 電轉膜儀轉膜（100mA 40分鐘） 
13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色 
14. Westernblot 試劑盒顯色 
15. 分析比較記錄 
western blot的實驗步驟及注意事項的資料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。 
1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。 
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。 
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。 
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。 
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。 
6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現(xiàn)時取出，記錄下標準位置。 
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。 
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。 
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。 
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。 
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃） 
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。 
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下?lián)u動1小時。 
11． 按步驟9洗滌。 
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。 
注意事項： 
western blot中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結構改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。