原理和程序 MethylFlash? 羥甲基化 DNA 定量試劑盒（比色法）包含了對整體 DNA 羥甲基化進(jìn)行比色定量所需的所有試劑。在該檢測中，DNA 結(jié)合到剝離經(jīng)過專門處理的孔中，這些孔具有高 DNA 親和力。使用捕獲和檢測抗體檢測 DNA 的羥甲基化部分，然后通過在微孔板分光光度計中讀取 450 nm 處的吸光度，通過類似 ELISA 的反應(yīng)進(jìn)行定量。羥甲基化 DNA 的量與測得的 OD 強(qiáng)度成正比，這可以通過試劑盒中包含的兩種不同 DNA 樣品的相對羥甲基化狀態(tài)公式或使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對 5-羥甲基胞嘧啶 （5-hmC） 的絕/對定量進(jìn)行計算。
簡單、快速、靈活 整個比色測定具有易于遵循的步驟，方便快捷，可在 3 小時 45 分鐘內(nèi)完成。條孔微孔板規(guī)格允許在手動或高通量分析中進(jìn)行靈活的分析。試劑盒包含通用陽性和陰性對照，用于定量來自任何物種（如哺乳動物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒）的羥甲基化 DNA。
安/全方便 定量整體 DNA 羥甲基化所需的所有試劑，包括陰性對照和陽性對照，都方便地包裝在試劑盒中。DNA 樣品的直接比色定量取代了過時或劣質(zhì)的方法，無需 DNA 消化/變性、放射性、提取或色譜分析。
高靈敏度和特異性 新穎的程序和專有的試劑盒組成能夠以高靈敏度和特異性實(shí)現(xiàn)羥甲基化 DNA 的準(zhǔn)確定量。起始 DNA 的檢測限可低至 40 pg 的羥甲基化 DNA，動態(tài)范圍為 40 pg 至 20 ng（見圖 2）。分析靈敏度比 HPLC 高約 10 倍（0.008% 對 0.08%）。與甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶沒有交叉反應(yīng)性，因此僅檢測到羥甲基化 DNA （5-hmC）（見圖 3）。
反應(yīng)靈敏、可靠且實(shí)用 基于其工作原理和微孔板形式，該試劑盒可實(shí)際和常規(guī)地用于各種形式的任何物種，包括培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮和冷凍組織、石蠟包埋組織、血漿/血清樣品和體液樣品。為了證明該試劑盒的功能，它已成功用于定量小鼠大腦和 HeLa 細(xì)胞 DNA 中 5-hmC 的含量。MethylFlash? 試劑盒測得的 5-hmC 百分比與 HPLC 和 LC-MS 方法檢測的百分比平行且相當(dāng)（參見表 1）。通過使用該試劑盒，首/次在正常人腦和結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)了高豐度的 5-hmC。此外，它表明 5-hmC 分別占正常人腦和結(jié)腸組織中總甲基化胞嘧啶（5-mC 加 5-hmC）的 32% 和 16%（見表 2）。相比之下，結(jié)腸癌細(xì)胞系 （HCT116） 和宮頸癌細(xì)胞系 （HeLa） 中的 5-hmC 較低或不存在（參見圖 4A 和 4B）。
表 1.MethylFlash? 羥甲基化 DNA 定量試劑盒與基于色譜法檢測 5-羥甲基胞嘧啶的方法的比較，以兩種 DNA 樣品類型中存在的 5-hmC 的百分比表示。
1Munzel M 等人：Angewandte Chemie，122：ePub，2010 年
表 2.分別用 MethylFlash? 羥甲基化 DNA 定量試劑盒和 MethylFlash? 甲基化 DNA 定量試劑盒測量不同組織/細(xì)胞中 5-hmC 和 5-mC 的百分比。
圖 4.證明人腦和結(jié)腸組織中 5-羥甲基胞嘧啶豐度高。將 200 ng 從不同組織或細(xì)胞中分離的 DNA 加入檢測孔中，并使用 MethylFlash? 羥甲基化 DNA 定量試劑盒測量 DNA 的羥甲基化部分。A： 在各種 DNA 樣品中測量的 OD 強(qiáng)度。B：各種組織和細(xì)胞中羥甲基化 DNA 的百分比。
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