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基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?；蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。本文對(duì)三種基因敲除技術(shù)作比較，描述它們的優(yōu)缺點(diǎn)。
基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)
1、優(yōu)勢(shì)：成熟、可靠、精細(xì)是目前為止**一個(gè)可以滿足所有要求的打靶技術(shù)
2、局限性：
A 需要ES細(xì)胞，目前只有小鼠有高效的ES細(xì)胞，其它模式動(dòng)物的ESC還不能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。
B 周期長(zhǎng)、工作量大、費(fèi)用相對(duì)比較高
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除模式小鼠
B 條件性基因敲除模式小鼠
C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠
D 基因敲入模式小鼠
E ROSA位點(diǎn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因
TALEN技術(shù)
1、優(yōu)勢(shì)：基因敲除效率高，速度快，可實(shí)現(xiàn)多物種基因敲除
2、局限性：
基因敲入效率較低，多基因敲除困難，系統(tǒng)構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜，存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除大/小鼠
B 全基因敲除細(xì)胞系
EGE系統(tǒng)
1、優(yōu)勢(shì)：基因敲除/敲入效率高，速度快，可實(shí)現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單
2、局限性：
存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)，但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率，In vivo脫靶可通過傳代去除.
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠
B 全基因/條件性報(bào)告基因敲除/敲入大/小鼠
C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建
D 細(xì)胞系敲除/敲入
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研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。胎牛血清使用錯(cuò)誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 ℃太久。
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
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大鼠視網(wǎng)膜müller 大鼠視網(wǎng)膜müller細(xì)胞 細(xì)胞株培養(yǎng) 快速識(shí)別與處理常見細(xì)胞污染的招術(shù)：
1、細(xì)菌：
識(shí)別：細(xì)菌在顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，有球形，鏈形，桿形等。大家不必深究。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃，培養(yǎng)瓶頂部有一層細(xì)沙一樣的東西。就知道大事不好啦。
處理：可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理?？梢杂盟沫h(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。其實(shí)，毛毛蟲說句實(shí)話，一旦發(fā)生污染，就已經(jīng)大勢(shì)已去了。如果細(xì)胞不是特別特別珍貴的話，還是趁早扔了，重起爐灶吧。所以，*重要的還是防范于未然。做好培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作。在操作的時(shí)候，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作規(guī)范。
2、霉菌：
識(shí)別：因?yàn)榕囵B(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)為時(shí)過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮。細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間一長(zhǎng)，細(xì)胞的狀態(tài)就變差。
處理：細(xì)胞一旦被霉菌污染，很難挽救，兩性霉素B或制霉菌素都于事無(wú)補(bǔ)，建議果斷舍棄該污染細(xì)胞，將環(huán)境徹底消毒。
采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅。
3、支原體：
識(shí)別：多為多邊形，培養(yǎng)液一般會(huì)變渾濁。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是和你一起慢慢變老。支原體污染后，可影響所有的細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
處理：沒有什么好處理的。直接扔了吧。污染到其他的細(xì)胞就虧大發(fā)了。還是那句話，預(yù)防為主。
4、黑蛟蟲：
識(shí)別：誰(shuí)都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西。據(jù)說是納米級(jí)的細(xì)菌。低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響。但是如果太多了，也會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
處理：因?yàn)楦静恢肋@是什么物種，所以也談不上什么處理方式。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
5、真菌：
識(shí)別：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培養(yǎng)液清亮，所以很難早期發(fā)現(xiàn)。鏡下有時(shí)候象絲狀，有時(shí)候象珊瑚狀。慢慢地會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。這個(gè)時(shí)候，已經(jīng)晚了，細(xì)胞很難救活了。
處理：同霉菌污染一樣，沒有什么好處理的，直接扔了吧。然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。
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