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基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的,是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?;蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點,以達(dá)到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。本文對三種基因敲除技術(shù)作比較,描述它們的優(yōu)缺點。

基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)

1、優(yōu)勢:成熟、可靠、精細(xì)是目前為止**一個可以滿足所有要求的打靶技術(shù)

2、局限性:

A 需要ES細(xì)胞,目前只有小鼠有高效的ES細(xì)胞,其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。

B 周期長、工作量大、費用相對比較高

3、可提供服務(wù)類型:

A 全基因敲除模式小鼠

B 條件性基因敲除模式小鼠

C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠

D 基因敲入模式小鼠

E ROSA位點定點轉(zhuǎn)基因

TALEN技術(shù)

1、優(yōu)勢:基因敲除效率高,速度快,可實現(xiàn)多物種基因敲除

2、局限性:

基因敲入效率較低,多基因敲除困難,系統(tǒng)構(gòu)建相對復(fù)雜,存在脫靶風(fēng)險

3、可提供服務(wù)類型:

A 全基因敲除大/小鼠

B 全基因敲除細(xì)胞系

EGE系統(tǒng)

1、優(yōu)勢:基因敲除/敲入效率高,速度快,可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入,系統(tǒng)構(gòu)建簡單

2、局限性:

存在脫靶風(fēng)險,但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率,In vivo脫靶可通過傳代去除.

3、可提供服務(wù)類型:

A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠

B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠

C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建

D 細(xì)胞系敲除/敲入

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研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80 ℃太久。

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷, 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

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人卵巢畸胎瘤 人卵巢畸胎瘤細(xì)胞 細(xì)胞株培養(yǎng) 快速識別與處理常見細(xì)胞污染的招術(shù):

1、細(xì)菌:

識別:細(xì)菌在顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,根據(jù)感染細(xì)菌的不同,可有不同的外形,有球形,鏈形,桿形等。大家不必深究。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃,培養(yǎng)瓶頂部有一層細(xì)沙一樣的東西。就知道大事不好啦。

處理:可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理??梢杂盟沫h(huán)素,慶大霉素,或者鏈霉素,前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。其實,毛毛蟲說句實話,一旦發(fā)生污染,就已經(jīng)大勢已去了。如果細(xì)胞不是特別特別珍貴的話,還是趁早扔了,重起爐灶吧。所以,*重要的還是防范于未然。做好培養(yǎng)間,CO2孵箱,器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作。在操作的時候,嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)范。

2、霉菌:

識別:因為培養(yǎng)液是清亮的,所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn),等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物,如同風(fēng)中柳絮。細(xì)胞仍可生長,但時間一長,細(xì)胞的狀態(tài)就變差。

處理:細(xì)胞一旦被霉菌污染,很難挽救,兩性霉素B或制霉菌素都于事無補(bǔ),建議果斷舍棄該污染細(xì)胞,將環(huán)境徹底消毒。

采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅。

3、支原體:

識別:多為多邊形,培養(yǎng)液一般會變渾濁。支原體感染細(xì)胞以后,細(xì)胞病變不很明顯,只是和你一起慢慢變老。支原體污染后,可影響所有的細(xì)胞生長參數(shù)。故進(jìn)行實驗前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

處理:沒有什么好處理的。直接扔了吧。污染到其他的細(xì)胞就虧大發(fā)了。還是那句話,預(yù)防為主。

4、黑蛟蟲:

識別:誰都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西。據(jù)說是納米級的細(xì)菌。低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。培養(yǎng)液也是不渾的,一般不會太影響。但是如果太多了,也會影響細(xì)胞生長和實驗結(jié)果。

處理:因為根本不知道這是什么物種,所以也談不上什么處理方式。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話,可以增加細(xì)胞的種板密度,以提高細(xì)胞的生存率。

5、真菌:

識別:真菌污染和霉菌污染差不多。一般培養(yǎng)液清亮,所以很難早期發(fā)現(xiàn)。鏡下有時候象絲狀,有時候象珊瑚狀。慢慢地會長出很細(xì)的黑色絲狀物。這個時候,已經(jīng)晚了,細(xì)胞很難救活了。

處理:同霉菌污染一樣,沒有什么好處理的,直接扔了吧。然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間,CO2孵箱,器皿和培養(yǎng)液。

 

細(xì)胞種類較多,本展臺無法一一體現(xiàn),以上是我司部分產(chǎn)品,若沒有看到您需要的細(xì)胞,請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系,歡迎來電咨詢,電話:400-968-7988。

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