人角膜成纖維 人角膜成纖維細胞 細胞株培養(yǎng)
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基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?；蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。本文對三種基因敲除技術(shù)作比較，描述它們的優(yōu)缺點。
基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)
1、優(yōu)勢：成熟、可靠、精細是目前為止**一個可以滿足所有要求的打靶技術(shù)
2、局限性：
A 需要ES細胞，目前只有小鼠有高效的ES細胞，其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。
B 周期長、工作量大、費用相對比較高
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除模式小鼠
B 條件性基因敲除模式小鼠
C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠
D 基因敲入模式小鼠
E ROSA位點定點轉(zhuǎn)基因
TALEN技術(shù)
1、優(yōu)勢：基因敲除效率高，速度快，可實現(xiàn)多物種基因敲除
2、局限性：
基因敲入效率較低，多基因敲除困難，系統(tǒng)構(gòu)建相對復(fù)雜，存在脫靶風(fēng)險
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除大/小鼠
B 全基因敲除細胞系
EGE系統(tǒng)
1、優(yōu)勢：基因敲除/敲入效率高，速度快，可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，系統(tǒng)構(gòu)建簡單
2、局限性：
存在脫靶風(fēng)險，但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率，In vivo脫靶可通過傳代去除.
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠
B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠
C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建
D 細胞系敲除/敲入
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研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 ℃太久。
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
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人角膜成纖維 人角膜成纖維細胞 細胞株培養(yǎng) 快速識別與處理常見細胞污染的招術(shù)：
1、細菌：
識別：細菌在顯微鏡下為黑色細沙狀，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形，有球形，鏈形，桿形等。大家不必深究。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃，培養(yǎng)瓶頂部有一層細沙一樣的東西。就知道大事不好啦。
處理：可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理。可以用四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。其實，毛毛蟲說句實話，一旦發(fā)生污染，就已經(jīng)大勢已去了。如果細胞不是特別特別珍貴的話，還是趁早扔了，重起爐灶吧。所以，*重要的還是防范于未然。做好培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作。在操作的時候，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)范。
2、霉菌：
識別：因為培養(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮。細胞仍可生長，但時間一長，細胞的狀態(tài)就變差。
處理：細胞一旦被霉菌污染，很難挽救，兩性霉素B或制霉菌素都于事無補，建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境徹底消毒。
采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅。
3、支原體：
識別：多為多邊形，培養(yǎng)液一般會變渾濁。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是和你一起慢慢變老。支原體污染后，可影響所有的細胞生長參數(shù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
處理：沒有什么好處理的。直接扔了吧。污染到其他的細胞就虧大發(fā)了。還是那句話，預(yù)防為主。
4、黑蛟蟲：
識別：誰都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西。據(jù)說是納米級的細菌。低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響。但是如果太多了，也會影響細胞生長和實驗結(jié)果。
處理：因為根本不知道這是什么物種，所以也談不上什么處理方式。建議如果細胞有可能是此種污染的話，可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率。
5、真菌：
識別：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培養(yǎng)液清亮，所以很難早期發(fā)現(xiàn)。鏡下有時候象絲狀，有時候象珊瑚狀。慢慢地會長出很細的黑色絲狀物。這個時候，已經(jīng)晚了，細胞很難救活了。
處理：同霉菌污染一樣，沒有什么好處理的，直接扔了吧。然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。
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