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10437-085 拜力生物 胎牛血清gibco/gibco

基因組DNA提取

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酵母雙（單）雜交cDNA文庫構建

1. 服務流程

1.1 客戶樣品QC

1.2 Total RNA的提取。

1.3 mRNA的分離。

1.4 以mRNA為模板進行cDNA雙鏈的合成。

1.5 對合成的cDNA雙鏈進行分級純化。

1.6 將分級純化的cDNA與pDONR222載體進行重組反應。

1.7 將重組產物轉化DH10B感受態(tài)細胞。

1.8 cDNA文庫的QC。

a) 檢測文庫庫容量。

b)隨機挑取32個克隆子，PCR檢測平均插入片段大小，陽性率。

1.9 初級文庫鋪板，抽提質粒

1.10 初級文庫質粒與PDEST22（或者pGADT7,pGADT7-Rec,pGADT7-Rec2, PCDNA3.1 或者其他任意指定

載體，根據(jù)客戶需求確定載體）載體進行重組反應，電轉化，檢測文庫質量。

a) 檢測文庫庫容量。

b)每個文庫隨機挑取32個克隆子，PCR檢測平均插入片段大小，陽性率。

2.送樣要求

2.1 針對每個文庫，客戶需提供至少能提取500ug總RNA的樣本，或者至少500ug總RNA。

3.發(fā)貨內容

3.1 我們提供構建好的酵母文庫的甘油菌液（含20%甘油的LB培養(yǎng)基），擴增后初級文庫甘油菌，初級

文庫中抽質粒，隨機克隆子的PCR鑒定圖譜，文庫構建報告，酵母雙雜交篩選相關細胞和質粒。

4.質量標準

4.1 文庫庫容量：大于1*10^7 CFU。

4.2 平均插入片段：大于1.2Kbp。

4.3 陽性率：大于95%。

5.服務時間

30個工作日內

收費：人民幣30000.00

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基因甲基化檢測

甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程。DNA甲基化修飾現(xiàn)象廣泛存在于多種有機體中，是*早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是表觀遺傳學（Epigenetics）的重要組成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改變DNA的**結構，但是能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而在基因的表達及其調控、DNA的復制、細胞的生長發(fā)育、X染色體失活、衰老以及許多人類疾病 （如發(fā)育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)心理失調等）發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。 DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鳥嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多發(fā)于CpG二核苷酸序列中，基因組中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基轉移酶（DNMT）的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶極易在進化中丟失，高等真核生物中CpG序列遠遠低于其理論值，但在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動子和**外顯子區(qū)，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，形成所謂的CpG島。哺乳類基因組中約存在4萬個CpG島，大多位于轉錄單元的5’區(qū)。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。因此，基因啟動子甲基化檢測在**診斷、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應用價值。

服務項目：

1．甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

      用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。

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特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發(fā)生甲基化。

2．亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，*后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。

   特點：**度高，能夠準確檢測出甲基化的程度百分比。

送樣要求：

細胞（≥106 個）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，基因組DNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。

服務價格：