關鍵詞:細胞毒實驗(MTT法)技術服務|實驗技術服務
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細胞毒實驗(MTT法)技術服務|實驗技術服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> （Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit） 以MTT為指示劑，在經(jīng)典操作方法的基礎上，采用了獨特的甲簪溶解液，可以直接溶解甲簪，而無需離心去除原有的培養(yǎng)液，故可避免因甲簪部分被吸除而引起的操作誤差，具有本底低，靈敏度高，線性范圍寬，操作簡便等特點。  
保存條件 
    MTT溶液-20℃保存，一年有效；Formazan溶解液室溫或-20℃保存。 
使用說明 
    1. 細胞的增殖和細胞毒實驗，一般可在96孔細胞培養(yǎng)板中進行。 
    2. 每孔加入100微升細胞懸液。細胞的數(shù)量取決于實驗目的和培養(yǎng)時間。增殖實驗每孔通常加入103個以上數(shù)量的細胞；細胞毒性實驗每孔至少加入5x103個或以上數(shù)量的細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素確定）。 
    3. 接種的細胞按照實驗需要，送入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。增殖實驗通常要給予0-10微升特定的藥物或生長因子進行刺激。細胞毒實驗通常要給予0-10微升抑制因子或細胞藥物； 
    4．培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20微升MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3－6小時；   
    5．孵育結(jié)束后，每孔加入100微升Formanzan溶解液，在37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在鏡下觀察formazan全部溶解。通常37℃孵育4小時左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時間會略長。  
    6. 在570nm測定吸光度。如無570nm濾光片， 560-600nm范圍的濾光片均可使用。
步驟
1、接種細胞 :用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
2、培養(yǎng)細胞 :同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間)。
3、呈色 :培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
4、比色 :選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
注意事項
1、選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。
2、避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，*后比色以空白調(diào)零。
MTT實驗吸光度*后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，
IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50%抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可!