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實時熒光定量PCR服務|實驗技術服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 1 收集樣品
2 相關試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預混試劑)。
3 實驗儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機。
4 總RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系。混勻后70℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應條件設置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?br> 6 引物設計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 實時定量PCR 按以下反應體系進行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴增反應條件設置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環(huán))。
8 PCR產(chǎn)物溶解曲線分析 將所擴增的PCR 產(chǎn)物進行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增產(chǎn)物。溶解曲線生成的反應程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
9 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。
實時熒光定量PCR技術的主要應用
1. DNA 或RNA 的**定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等;
2. 基因表達差異分析:例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證;
3. 基因分型:例如SNP 檢測，甲基化檢測等。
幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：
1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：利用生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，*終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。