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平板細(xì)胞克隆形成試驗技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 概念：
細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。
基本步驟：
1、取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。*后計算克隆形成率。
克隆形成率 =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%
平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團，接種密度不能過大。
PCR反應(yīng)條件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30  72℃ 5min.4℃保溫 
或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10  72℃ 5min.4℃保溫
注：
1一般一個項目要挑選5個單菌落做菌落PCR
2在以菌落為模板時要事先準(zhǔn)備相應(yīng)抗性平板，用槍頭挑選菌落時要先在事先準(zhǔn)備的相應(yīng)平板上劃線標(biāo)記好順序再將槍頭放入上述反應(yīng)體系中攪勻一下。
3該PCR 的primer 為通用primer 所以在原來目的片段的大小上加上100-200bp。
瓊脂糖凝膠電泳檢測：取5ul樣品+5ul DNA Loading buffer混勻上樣，150V恒壓電泳20-30min，保存電泳圖片。根據(jù)大小判斷該菌落是否正確。下班前挑?。ㄔ趧澗€的板子上）篩選正確的菌體接種到5ml 含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基37℃ 200rmp培養(yǎng)。
常用以下方法獲得DNA片段：
①用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；
②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；
③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應(yīng)的基因片段；
④從mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。 
克隆的選擇： 
①直接篩選：有些載體帶有可辨認(rèn)的遺傳標(biāo)記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變?yōu)榍辶?；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍(lán)色變?yōu)闊o色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。 
②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標(biāo)記基因，當(dāng)外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個抗藥性基因，當(dāng)外源基因插入到B基因區(qū)后，便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A藥培養(yǎng)基上正常生長而不能在B藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。 
③核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。 
④免疫學(xué)方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達(dá)，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進(jìn)行原位雜交，選擇特異的克隆。