關(guān)鍵詞:明膠酶譜技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 酶譜法的基本過程是先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE，含0.1%明膠)電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，*后用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
試劑的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(含1.0mg/ml 明膠，配好后1周內(nèi)使用，明膠含量低靈敏度高)
A.分離膠的配制(注:根據(jù)你所用的電泳儀膠的大小確定配制膠的量)
10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 10ml(包括)
ddH2O 4.5ml
30%儲備膠(0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺) 2ml
1.5mol/l Tris(PH 8.8) 2.5ml
10% SDS 100u
10%過硫酸銨(APS) 100ul
TEMED 8ul
1%明膠(1g明膠-->100ml，37°C水浴溶解) 0.5ml
B.濃縮膠的配制
濃縮膠 6ml
ddH2O 4.5ml
30%儲備膠 0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%過硫酸銨 60ul
TEMED 6ul
(3)5×Tris –甘氨酸電極緩沖液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS(PH 8.3)
(4)4 ×上樣緩沖液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS(PH7.2) 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚藍 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脫液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 (40分鐘兩次，中間換液)
(6)漂洗液: 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 (20分鐘2次)
(7)孵育液:50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3(孵育42小時)
(8)染色液:0.05% Coomassic 亮藍 R-250，30%甲醇，10%乙酸(染色3小時)
(9)脫色液A、B、C:甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5% (分別30min、1h、2h脫色)
實驗步驟
1.取對數(shù)期的癌細胞在的無血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24h。
2.次日收集上清液，將上清液移入離心管中 2000rpm 離心10min，-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)細胞計數(shù)調(diào)整各組細胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度(或者測定蛋白濃度調(diào)整使所上蛋白總量一致)。與5×上樣緩沖液混合，13ul樣本+4ul上樣緩沖液。(不要用槍用力吹打，防止出現(xiàn)過多氣泡)
4.配制分離膠和濃縮膠，16ul/孔上樣(根據(jù)表達強度和蛋白濃度確定上樣量)，4℃進行SDS-PAGE 電泳100v約1.5小時(電泳時在周圍敷上冰，有利于使條帶跑直)。
5.電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic 亮藍、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%) 分別脫色0.5、1、2h后，顯示出MMP-2(72KD) 和MMP -9(92 KD)為位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統(tǒng)計分析。
注意事項
1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡 。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH*好在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明膠要4度保存，配好后1周內(nèi)使用
凝膠制備
1.玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，*后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。
3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED*后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。
4.將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產(chǎn)生氣泡，否則加樣時易導(dǎo)致逸出而使結(jié)果不準(zhǔn)確。