關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
PI 染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定。
4、離心，棄上清液。
5、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，離心。
7、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min。
9、混勻，過(guò)300目篩網(wǎng)，置流式管中， 4℃冰箱保存，待測(cè)。
GFP PI染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃固定30min。
以下步驟同PI 染色操作步驟的
細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm，5min，棄上清液。
2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。
3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、離心棄上清液。
5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。
細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3、 用PBA稀釋的**抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h。離心，棄上清。
4、 BS1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的**抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。
6、 PBS 1ml離心洗滌2次。
7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
5、0、1% Triton-100 1ml, 室溫10min。
6、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8、離心棄上清液。
9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
10、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7、加入用PBA稀釋的**抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心，棄上清。
8、冷PBS1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的**抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。
10、冷PBA1ml離心洗滌2次。
11、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。
備注：                                                
1、RNase A：貯液濃度：1mg/ml；
工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 20ug/ml。
2、PI：貯液濃度：2、5mg/ml；       
工作液配制：加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 50ug/ml。
3、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0、1%疊氮鈉。
4、檢測(cè)樣品細(xì)胞濃度1x106 /ml。