關(guān)鍵詞:流式分選實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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流式分選實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1 作用原理：
對(duì)實(shí)體組織分散的作用原理主要有3方面：① 可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等；②可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì)；③可以水解組織細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì)物質(zhì)。酶消化法是實(shí)體瘤、培養(yǎng)細(xì)胞分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋白酶類——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細(xì)胞。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維。不同酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來(lái)確定使用的酶類。
2 注意事項(xiàng)：
① 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐?，而這些溶液不致于造成酶效價(jià)降低；②要注意酶的使用濃度和消化時(shí)間；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等；④ 要隨時(shí)注意影響酶活性的其它因素，如酶的生產(chǎn)批號(hào)等。
3 方法學(xué)程序
（1） 將適合于酶消化的組織置于離心管中；
（2） 將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中；
（3） 一般消化20-30分鐘（恒溫37℃或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打；
（4） 終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，以低速成離心除去細(xì)胞碎片；
（5） 將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行進(jìn)一步熒光染色后上機(jī)檢測(cè)，或保存?zhèn)溆谩?br> 機(jī)械法分散實(shí)體組織包括：用手術(shù)剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用300目尼龍網(wǎng)濾出單細(xì)胞懸液；采用搓網(wǎng)法也能獲得大量細(xì)胞。機(jī)械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以機(jī)械法常與其它方法配合使用。
1 剪碎法：
① 將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；
② 用剪刀將組織剪至勻漿狀；
③ 加入10ml生理鹽水；
④ 用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到試管中；
⑤ 離心沉淀1000prm,3-5min，再用生理鹽水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短時(shí)離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
⑥ 以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊；
⑦ 細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 2 網(wǎng)搓法
① 將100目，300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上；
② 把剪碎的的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完；
③ 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀500-800prm，2分鐘；
④ 固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 3 研磨法
準(zhǔn)備一只70ml研磨器。
① 先將組織剪成1-2mm3大小組織塊；
② 放入組織研磨器中加入1-2ml生理鹽水；
③ 轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研至勻漿；
④ 加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器；
⑤ 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理鹽水洗3 遍，離心沉淀；
⑥ 固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用。