關(guān)鍵詞:酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界****酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝**，質(zhì)量保證,價(jià)格優(yōu)惠。
酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶(hù)不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶(hù)可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：酵母雙(單)雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
原理
酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相互作用。(2）研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能，即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)。
ProQuest系統(tǒng)依靠報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)鑒定蛋白相互作用。將一個(gè)基因克隆到'誘餌'載體，pDEST32，并和GAL4蛋白的DNA結(jié)合域（DBD）表達(dá)為融合蛋白。將**個(gè)基因或者編碼可能的相互作用子蛋白的cDNA文庫(kù)克隆到'獵物'載體，pDEST22，同GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩個(gè)蛋白相互作用時(shí)，AD和DBD間距離被拉近，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)
服務(wù)流程
1) 提取總RNA，分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。
2) 將cDNA與pDONR222載體進(jìn)行BP重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞。
3) 甘油保存大腸桿菌文庫(kù)。
4) 提取大腸桿菌文庫(kù)質(zhì)粒DNA，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞
5) 大腸桿菌文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化酵母菌，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率，
6) 收集酵母轉(zhuǎn)化子，測(cè)定文庫(kù)效價(jià)。
7) 甘油保存酵母菌文庫(kù)。
使用優(yōu)點(diǎn)： 在擁有相關(guān)組織基因文庫(kù)的情況下
1 ）    可以用來(lái)比對(duì)病變組織更快的找到突變基因或者導(dǎo)致變異的蛋白，更快的找到攻克方向。
2 ）    可以用作大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)找到某些藥物對(duì)相關(guān)組織主要的作用蛋白，對(duì)于藥物的修飾和改進(jìn)明確方向。
3 ）    可以反復(fù)使用，培養(yǎng)時(shí)間短，適合大規(guī)模篩選使用。
4 ）    作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。
5 ）    檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。
試驗(yàn)步驟:
1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml離心管中，加RNase-free water 補(bǔ)足到500ul
2. 根據(jù)表3加入適當(dāng)體積的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 輕彈1.5ml離心管徹底混勻
3. 置于70℃水浴中3min
4. 取出置于室溫(20℃-30℃)10min
5. 13000rpm室溫離心 2min，用移液器吸出上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中，保留上清直到polyA被結(jié)合上。
6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混勻沉淀物，將混合物轉(zhuǎn)移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，離心1min
7. 將Spin Column 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，離心1min
9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3-4次樹(shù)脂，室溫 13000rpm，離心1min。
10. 測(cè)OD,并電泳定量。
cDNA構(gòu)建成功關(guān)鍵因素 
1.  保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA
2.  反轉(zhuǎn)錄成功與否及反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵
3.  層析柱cDNA分級(jí)很關(guān)鍵