關(guān)鍵詞:基因組文庫(kù)(Genomic Library)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因組文庫(kù)(Genomic Library)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：基因組文庫(kù)(Genomic Library)構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
基因組DNA文庫(kù)包括了基因組所有順序的隨機(jī)克隆片段。一個(gè)好的基因組DNA文庫(kù)的大小應(yīng)足夠大，以便包括所有的基因DNA順序。DNA克隆片段也應(yīng)足夠大，其中包括整個(gè)基因、連接基因及它們穩(wěn)定形式所要的側(cè)翼順序。為了獲得高的克隆效率和較大的插入片段，λ噬菌體載體和質(zhì)粒經(jīng)常被使用構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。λ噬菌體文庫(kù)易于操作，噬菌體載體上有多克隆位點(diǎn)。λ噬菌體能容納10-50kb插入DNA，載體類型應(yīng)根據(jù)所要基因組DNA的大小和用途來選擇。
構(gòu)建一個(gè)基因組DNA文庫(kù)的基本步驟：
①分離純化基因組DNA；
②切割DNA成合適大小的片段以用于克??；
③載體DNA的制備；
④把基因組DNA段和載DNA連接；
⑤包裝重組分子；
⑥測(cè)定入噬菌體滴度；
⑦擴(kuò)增DNA文庫(kù)；
⑧評(píng)估文的質(zhì)量。
基因組文庫(kù)構(gòu)建步驟：1、載體： 
l噬菌體：48.5kb,插入型(*多可容納9kb)、取代型(可容納 38-51kb，*適19-20kb)， EMBL, Charon 粘性質(zhì)粒(Cosmid)：4-6kb, 質(zhì)粒+噬菌體的性質(zhì)，可容納大片段的外源基因，*多可容納46kb。 酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast Artificial Chromosome  Cloning System） 插入大小200—1000kb 2、 載體DNA的制備： 高分子量的外源DNA 100-150kb載體DNA酶切反應(yīng)-----載體臂的純化-----載體脫磷處理 www.cqwestern.com（常用BamHI）   （蔗糖密度梯度離心）  （堿性磷酸酶） 3、連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白 4、感染宿主菌：選擇合適的宿主菌，LE392, NM538, NM539, KW251等 5、基因組文庫(kù)的保存和擴(kuò)增： 6、測(cè)滴度，要在106fu以上
7、保存：氯仿4℃，7% DMSO -70℃
需要注意：
(1)電泳時(shí)，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準(zhǔn)確定位所需分子量的DNA。
(2)電泳以后，應(yīng)盡量縮短用紫外光照射目標(biāo)DNA的時(shí)間，否則會(huì)顯著降低克隆效率。
(3)回收DNA的時(shí)候，應(yīng)該要避免過度離心，以防止DNA被剪切，降低文庫(kù)質(zhì)量。
方法
1。將50μl BAC轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物接種到500ml含12。5μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 震蕩(280rpm)培養(yǎng)12到16小時(shí)。
2。2500g，4℃，離心15min，收集菌體。
3。用100ml冰預(yù)冷的STE重新懸浮細(xì)菌沉淀。按步驟2方法離心收集細(xì)菌。
4。用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細(xì)菌。加溶菌酶至終濃度為1mg/ml。
5。加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II。蓋緊離心瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次，使內(nèi)容物完全混勻，冰裕5min。
6。加入24ml冰預(yù)冷的堿性裂解液III，蓋緊瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次，使內(nèi)容物完全混勻，置冰上5min。
7。15000g，4℃，離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心瓶中，棄沉淀。
8。加等體積的酚：氯仿。輕輕翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次，混勻。3000g，室溫離心15min。
9。將水相移至另一離心瓶中，加入等體積的異丙醇，翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次，混勻。
10。15，000g，室溫離心15分鐘，回收核酸沉淀。
11。棄上清，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12。棄乙醇，風(fēng)干使乙醇揮發(fā)殆盡。
13。小心將BAC DNA沉淀溶于0。2ml TE (pH8。0) 中。