關(guān)鍵詞:基因克隆與定點(diǎn)突變|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因克隆與定點(diǎn)突變|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法向目的DNA段(可以是基因組，也可以是質(zhì)粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。
定點(diǎn)突變的比較有特色的產(chǎn)品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根據(jù)準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒自行設(shè)計(jì)兩條引物(同一方向，對(duì)同一單鏈模版)，一條包含計(jì)劃定點(diǎn)突變的序列，另一條引物包含質(zhì)粒上某一個(gè)單酶切位點(diǎn)，不過(guò)在單酶切位點(diǎn)中引入突變，這樣兩條引物除了所包含的突變位點(diǎn)，其他序列和質(zhì)粒上對(duì)應(yīng)位置的序列完全一致，退火后和質(zhì)粒模版結(jié)合，通過(guò)T4 DNA聚合酶延伸，延伸反應(yīng)持續(xù)直到碰到另一條引物停止，兩段包含突變位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物經(jīng)T4連接成環(huán)，和模版鏈組成雜和環(huán)，帶有兩處錯(cuò)配。單酶切反應(yīng)產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯(cuò)配修復(fù)缺陷株)。原來(lái)的雙鏈質(zhì)粒模版被切開而不能轉(zhuǎn)化，而雜和質(zhì)粒由于一條鏈上單酶切位點(diǎn)引入突變而不被切開，保持環(huán)狀質(zhì)粒得以轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子的雜和雙鏈在E.coli的復(fù)制過(guò)程中分開，再經(jīng)過(guò)一輪提質(zhì)粒、單酶切、轉(zhuǎn)化，*后得到純和的突變質(zhì)粒。這個(gè)試劑盒則是利用改造單酶切位點(diǎn)使得新合成的突變質(zhì)粒不被切開從而除去原來(lái)的模版質(zhì)粒。
有的時(shí)候研究可能需要多個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，比如改造酶的活性或者動(dòng)力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點(diǎn)等，單點(diǎn)突變不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要，重復(fù)進(jìn)行單點(diǎn)突變也非常浪費(fèi)時(shí)間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。*多一次實(shí)驗(yàn)可以引入5個(gè)定點(diǎn)突變。這個(gè)試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準(zhǔn)備多個(gè)帶突變的引物(同方向，對(duì)同一單鏈模版)，退火后全部突變引物(不超過(guò)5個(gè))都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個(gè)引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個(gè)突變的單鏈環(huán)(mutant ssDNA)，得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個(gè)定點(diǎn)突變的效率為60%，5個(gè)定點(diǎn)突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點(diǎn)突變的質(zhì)粒，以引入3個(gè)定點(diǎn)突變?yōu)槔褪怯?0% 左右的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是帶有1-2個(gè)不同定點(diǎn)突變的質(zhì)粒(因?yàn)榇嬖?-2個(gè)引物結(jié)合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能)。
流程
定點(diǎn)突變一般須有含有待突變基因的高純度質(zhì)粒，不少于10μg，電泳圖清晰，達(dá)酶切及測(cè)序要求;
1.對(duì)待突變基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)突變方案;
2.根據(jù)突變方案設(shè)計(jì)合成覆蓋突變位點(diǎn)的雙向引物，合成目的DNA兩端引物，進(jìn)行高保真PCR反應(yīng);
3.默認(rèn)情況下，將PCR產(chǎn)物克隆至T載，或者根據(jù)要求亞克隆至目的載體;DNA測(cè)序驗(yàn)證突變序列的正確性。