關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> DNA甲基化是*早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。
檢測程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化;反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，*后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設(shè)計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化.
送樣要求
細胞(≥106 個)、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點與程度的實驗方法有三類：
（1）（M SREs）利用對甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點，從而產(chǎn)生片段差異，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點與甲基化程度，
（2）另一類是利用將沒有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì)，而甲基化的C不會發(fā)生相應(yīng)變化來識別甲基化位點。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進行檢測，Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù)，這項技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術(shù)的一個主要特點是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過峰值的高度可以**的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和**性。
 MSP 實驗流程：  
1.       基因組抽提；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實驗至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果，所以，需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率；
4.       引物設(shè)計（每個基因設(shè)計兩對引物，分別為：甲基化引物M，非基因化引物U，對應(yīng)擴增甲基化和非甲基化的目的片段），有時需設(shè)計巢式引物；
5.       PCR 擴增：對甲基化和非甲基化的目的片段分別擴增,此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度；
6.       PCR 產(chǎn)物電泳；
7.       電泳結(jié)果分析（定性即有無甲基化，半定量即甲基化程度高低）。
BSP （亞硫酸鹽測序法）實驗流程：  
1.       基因組抽提；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實驗至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果，所以，需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率；
4.       引物設(shè)計（每個基因設(shè)計一對引物，引物位置盡可能的避開DNA中的CG位點），有時需設(shè)計巢式引物；
5.       PCR 擴增：對實驗樣本進行PCR擴增，此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度。
6.       PCR 產(chǎn)物電泳；
7.       對目的條帶進行切膠回收；
8.       回收后的PCR產(chǎn)物連接克隆載體（T載體）；
9.       轉(zhuǎn)化E.coli H5α；
10.      挑選陽性克隆測序；
11.      測序結(jié)果分析：實驗專業(yè)甲基化分析軟件對測序序列進行甲基化分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：
     A. 測序序列與目的序列的相似度（%）；
     B. C-T 轉(zhuǎn)化效率（%）；
     C. 目的片段中每個CG的甲基化情況（點狀圖）；
     D. 每個CG的甲基化率(%)；