關(guān)鍵詞:滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
方法
1.   將切下的組織在手術(shù)臺(tái)上請(qǐng)將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中(靜止)，在手術(shù)完成時(shí)將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。
2.  在超凈臺(tái)中將標(biāo)本放入培養(yǎng)皿中，加入α-MEM洗滌。
3.  獲得組織切開(kāi)，仔細(xì)辨認(rèn)于關(guān)節(jié)反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關(guān)節(jié)軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細(xì)剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細(xì)胞)，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。
4.   用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動(dòng)混勻數(shù)次)
5.   30分鐘后收集**管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000轉(zhuǎn)離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過(guò)濾網(wǎng)的組織，繼續(xù)用于消化。
6.   離心管底細(xì)胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉(zhuǎn)，離心6分鐘，*后一次用記數(shù)板觀察到有細(xì)胞。細(xì)胞*終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
7.  60鐘后收集**管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，*后一次用記數(shù)板觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞*終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8.   必要時(shí)可做第三管細(xì)胞收集；并立即作原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng)。
9.  每2-3天換液一次。
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大鼠、兔，人手術(shù)切除的關(guān)節(jié)等；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基，補(bǔ)加15%小牛血清；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 將大鼠處死后，用75%酒精消毒；
2. 用手術(shù)剪剖開(kāi)其四肢皮膚與肌肉，暴露長(zhǎng)骨兩端的關(guān)節(jié)，取出關(guān)節(jié)面滑膜組織置于盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中；
3. 剔除滑膜組織外層結(jié)構(gòu)及周邊軟骨組織，用緩沖液洗2—3次；
4. 將滑膜組織置于盛有少量小牛血清的培養(yǎng)皿中，剪碎成1mm×1mm×1mm大小的植塊；
5. 將制備的植塊接種到螺旋口培養(yǎng)瓶中。反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使植有組織塊的一面朝上，加入培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋。將培養(yǎng)瓶放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
6. 培養(yǎng)4h后，組織塊較牢黏附于瓶底時(shí)，再輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)；
7. 培養(yǎng)3d后換培養(yǎng)液。
注意事項(xiàng)
1.   用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細(xì)胞或合用，只有單用collagenaseⅠ有用、*好；
2.   機(jī)械法很難獲得細(xì)胞；
3.  全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國(guó)產(chǎn)即可；
4.  必須用Ca2+-free的PBS。