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蛋白質(zhì)純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。
(1) 根據(jù)分子大小不同的分離方法:透析和超過(guò)濾(利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì));密度梯度離心(蛋白質(zhì)在介質(zhì)中離心時(shí)質(zhì)量和密度較大的顆粒沉降較快);凝膠過(guò)濾(一種柱層析)
(2) 利用溶解度差別分離:(等電點(diǎn)沉淀法)由于蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，減少了分子間靜電斥力，因而容易聚集沉淀，此時(shí)溶解度*小);鹽溶與鹽析(利用一定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質(zhì)的溶解度)
(3) 根據(jù)電荷不同的分離方法，主要包括電泳和離子交換層析分離;
(4) 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離(利用顆粒吸附力的強(qiáng)弱不同達(dá)到分離目的)
(5) 根據(jù)配體特性的分離--親和層析(利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異而非共價(jià)地結(jié)合這一生物性質(zhì))
(6) 低溫有機(jī)溶劑沉淀法: 用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
注意事項(xiàng):
在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化的時(shí)候，都要時(shí)刻注意維護(hù)它的穩(wěn)定性，保護(hù)它的活性，有一些通用的注意事項(xiàng)需要牢記，它們包括:
1、操作盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行。
2、不要太稀，蛋白濃度維持在μg/mL~mg/mL。
3、合適的pH，除非是進(jìn)行聚焦層析，所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同，防止蛋白質(zhì)的沉淀。
4、使用蛋白酶抑制劑，防止蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解;在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA對(duì)蛋白的污染。
5、避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動(dòng)，以防蛋白質(zhì)的變性。
6、緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。
7、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇)，防止蛋白質(zhì)的氧化。
8、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑，防止重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞。
9、使用滅菌溶液，防止微生物生長(zhǎng)。
一、電泳:
在克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)分析過(guò)程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時(shí)，通常都不采用電泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化蛋白質(zhì)，常用下述方法進(jìn)行:①?gòu)碾娪竞蟮哪z上切下所需的相應(yīng)條帶，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡，使其中的蛋白質(zhì)擴(kuò)散出來(lái)，從而獲得純化的蛋白質(zhì)。此法簡(jiǎn)單但回收率低。②將電泳后的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到溶液中，從而達(dá)到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。
二、色譜法:
色譜法(chromatography)是蛋白純化中*常用的一種方法，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質(zhì)，又可以保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。色譜的種類很多，可分為常規(guī)色譜和高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)。凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規(guī)色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜(reversed-phase HPLC,RP-HPLC)、離子交換高效液相色譜(ion exchange HPLC)等。根據(jù)目標(biāo)蛋白性質(zhì)的不同可選用相應(yīng)的色譜分離技術(shù)純化蛋白質(zhì)。
1.凝膠過(guò)濾色譜法
凝膠過(guò)濾色譜法(gel-filtration chromatography, GFC)又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀顆粒物質(zhì)，如瓊脂糖凝膠(sepharose)、葡聚糖凝膠(sephadex)，將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用于物質(zhì)的分離。
GFC可在存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強(qiáng)度、常溫或低溫等多種條件下進(jìn)行，根據(jù)所分離物質(zhì)的性質(zhì)不同可選擇相應(yīng)的色譜條件，從而獲得有生物學(xué)活性的純化的生物大分子。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的不同進(jìn)行分離的技術(shù)，通常包括吸附、吸收、擴(kuò)散、穿透、靜電引力等復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用于帶正電荷物質(zhì)的分離，而陽(yáng)離子交換劑可用于帶負(fù)電荷物質(zhì)的分離。
3.親和色譜
親和色譜法可在溫和條件下操作，純化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、分辨率高，對(duì)分離含量極少且性質(zhì)不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效。但由于不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對(duì)于某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應(yīng)用具有一定的局限性，主要由于蛋白質(zhì)尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。