關(guān)鍵詞:真菌18S rDNA/ITS菌種鑒定|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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真菌18S rDNA/ITS菌種鑒定|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1. 菌落形態(tài)觀察  
觀察菌落的大小、形狀、隆起度、邊緣、表面性狀、顏色與透明度、質(zhì)地和干濕度。 
2. 革蘭氏染色 
按照革蘭氏染色方法進(jìn)行制片、初染、媒染、脫色、復(fù)染、干燥、鏡檢；干燥后，用油鏡觀察。 
3. 鞭毛染色  
挑取18~30 h新鮮平板培養(yǎng)物制備菌懸液，制片，室溫自然干燥。滴加硝酸銀染色A液覆蓋3~5 min，用蒸餾水充分洗去A液，再滴加B液染色約1 min，當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗。自然干燥后用油鏡觀察。菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色。 
4. 糖類分解試驗(yàn) 
將被檢菌接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2－3天。如果培養(yǎng)基變黃，說明產(chǎn)酸；如變黃的同時(shí)，還有氣泡，說明既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣。培養(yǎng)基仍呈藍(lán)色，說明未產(chǎn)酸。選取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 
5. 吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn) 
將待檢菌種接種于鄧享氏蛋白質(zhì)的胨溶液中，37℃培養(yǎng)1－2天。于培養(yǎng)液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，搖勻，靜置片刻后，沿管壁加入試劑2ml，如出現(xiàn)紅色沉淀，表示為陽性。 
6. 淀粉水解試驗(yàn) 
將LB瓊脂加熱融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混勻后，傾注平板。將細(xì)菌劃線接種于平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，生長后取出，在菌落處滴加革蘭氏碘液少許，培養(yǎng)基呈深藍(lán)色，能水許解淀粉的細(xì)菌菌落周圍有透明環(huán)。 
9. V－P試驗(yàn) 
將被檢菌接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml水中，分裝于試管中，0.075MPa滅菌10分鐘），培養(yǎng)2－7天后，于培養(yǎng)物中加入1ml 10％的NaOH，混勻，再加入3－4滴2%氯化鐵溶液。數(shù)小時(shí)后，培養(yǎng)基表面的下層出現(xiàn)紅色者，為陽性。 
10.甲基紅（M.R）試驗(yàn) 
接種細(xì)菌，于37℃培養(yǎng)2－7天后，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅酒精溶液（0.1g甲基經(jīng)溶于300ml 95%乙醇中，加蒸餾水至500 ml），如呈紅色，表示陽性。 
11. 檸檬酸鹽利用試驗(yàn) 
將被檢菌接種到Simmons固體檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)2－4天，能利用檸檬酸鹽的細(xì)菌表現(xiàn)為有細(xì)菌生長，培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，不能利用檸檬酸鹽的細(xì)菌不生長，培養(yǎng)基不變色。 
12. 硝酸鹽還原試驗(yàn) 
將被檢細(xì)菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1－2天，每管中先加入甲試劑0.1ml，再加乙試劑數(shù)滴，如出現(xiàn)紅色，表示陽性。 
13. 接觸酶試驗(yàn) 
將1ml 3%的H2O2傾注于生長物（菌落或菌苔）上，有氣泡（O2）發(fā)生者為陽性。也可于清潔小試管中加少量H2O2（30%），再用清潔無菌的細(xì)玻棒（或火焰封口的毛細(xì)管或鎳鉻做成的接種環(huán)）醮細(xì)菌少許，插入H2O2液面下，有氣泡者為陽性。也可在玻片上滴一滴H2O2 蘸取少許培養(yǎng)物，混合，有氣泡者為陽性。 
14.16srDNA分析