關(guān)鍵詞:熒光原位雜交FISH技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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熒光原位雜交FISH技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)方法及步驟
1.  探針變性
將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈DNA探針變性。
2.  標(biāo)本變性
（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。 
（2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min。 
（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5 min，然后空氣干燥
3.  雜交
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交（約15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。
4.  洗脫
此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。
（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。 
（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。 
（3） 在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。 
（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下。 
（5） 取出玻片，自然干燥。 
（6） 取200 μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
5.  雜交信號的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）
（1） 在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。 
（2） 去掉保鮮膜，再加150 μL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40 min。 
（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。 
（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。
（5） 去掉保鮮膜，加150 μL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。 
（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。 
（7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 
（8） 取出玻片，自然干燥。 
（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
6.  封片
可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
7.  熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果
先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490 nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。