關(guān)鍵詞:細(xì)胞轉(zhuǎn)染|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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細(xì)胞轉(zhuǎn)染|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：細(xì)胞轉(zhuǎn)染|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
一、細(xì)胞傳代
1. 試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次
3. 用tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。
4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
5. 用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開(kāi)。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
7. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。
8. 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，**天轉(zhuǎn)染。
二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。
6. 到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。
三、**次細(xì)胞傳代
1. 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
2. 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。