關(guān)鍵詞:細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
概念：
細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
1．試劑與材料
(1)供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。
(2)1640培養(yǎng)液100ml。
(3)完全1640液100ml。
(4)2.5%FCS－1640液50ml。
(5)HAT培養(yǎng)液100ml。
(6)50%PEG：取分子量4000，高純度的（日本進(jìn)口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預(yù)熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調(diào)pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調(diào)整。
(7)10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培養(yǎng)盤。
2．操作方法
⑴準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。
⑶室溫400g離心3min，使細(xì)胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸輕敲管底部，使沉淀流動(dòng)，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達(dá)融合溫度。
⑹加預(yù)熱至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程要求持續(xù)2min。
⑺加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)1min。
⑻重復(fù)⑺一次。
⑼加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)0.5min。
⑽重復(fù)⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室溫，400g離心1min，使細(xì)胞沉淀。
⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細(xì)胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
⒂輕搖后，放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
⒃第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。
⒅對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。
主要特性:
①蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)；
②淋巴細(xì)胞亞群的表面新抗原；
③組織相容性抗原；
④激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；
⑤腫瘤的定位和分類；
⑥純化微生物和寄生蟲抗原；
⑦免疫治療和與藥物結(jié)合的免疫-化學(xué)療法 。