關(guān)鍵詞:微生物菌群多樣性分析(DGGE)|實驗技術(shù)服務(wù)
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> DGGE是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當它到達其變性要求的*低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態(tài)，這就導致其遷移速率變慢，由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是一種很有用分子標記方法。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物多樣性調(diào)查、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測等多個領(lǐng)域。
主要步驟
DGGE對微生態(tài)的分析一般包括三個步驟:核酸提取，16SrRNA序列的PCR擴增以及DGGE指紋圖譜分析。有些學者通過克隆、測序建立微生物區(qū)系的16SrRNA/DNA文庫，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，建立進化樹，從而獲得微生物多樣性信息，但這種方法相對于指紋圖譜技術(shù)來說，費時費力，價格也相對昂貴。
核酸提取
微生物總DNA的提取是整個分子生物學技術(shù)的基礎(chǔ),是否能獲得具有代表性的總DNA樣品將決定后續(xù)分析的可行性。一般認為微生物提取總DNA的方法分為細胞裂解和核酸抽提兩個步驟。細胞裂解有三種:機械法、化學法和酶法。機械法包括玻璃珠法、超聲波法、凍融法等;化學法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。而許多研究者用其中兩種或三種方法進行組合,發(fā)現(xiàn)組合后提取總DNA 的效果較好。Stahl等(1988)在含有SDS和酚的體系中加入適量的玻璃微珠DNA螺旋
DNA螺旋,機械法裂解瘤胃樣品中的菌體細胞。
16SrRNA基因序列的PCR擴增 
細菌的核糖體RNA按沉降系數(shù)分為5S、16S和23S三種,16SrRNA基因是細菌染色體上編碼該rRNA的相應(yīng)DNA系列。16SrRNA基因序列全長1540bp ,有保守區(qū)和可變區(qū)之分,每種細菌的保守區(qū)都是相同的,能反映生物種類的親緣關(guān)系,為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索;可變區(qū)因細菌種類而異,通過保守區(qū)設(shè)計引物,擴增出可變區(qū),就可以得知微生物多樣性信息。
DGGE指紋圖譜分析
DGGE電泳圖譜的分析*常用的是相似性聚類分析法。DGGE 膠通過掃描儀輸入計算機,通過Molecular Analysis軟件進行相似性分析。通過DGGE后得到的指紋圖譜,每一條帶代表某個微生物優(yōu)勢菌群,通過測序和序列比對,可以得出此優(yōu)勢菌群的種類。