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實時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 1 收集樣品
2 相關(guān)試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預(yù)混試劑)。
3 實驗儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機(jī)。
4 總RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機(jī)引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系?；靹蚝?0℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應(yīng)條件設(shè)置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應(yīng)。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?br> 6 引物設(shè)計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 實時定量PCR 按以下反應(yīng)體系進(jìn)行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環(huán))。
8 PCR產(chǎn)物溶解曲線分析 將所擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。溶解曲線生成的反應(yīng)程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
9 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。
實時熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用
1. DNA 或RNA 的**定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等;
2. 基因表達(dá)差異分析:例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證;
3. 基因分型:例如SNP 檢測，甲基化檢測等。
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
此方法適用于:
1、靈敏度高:使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上
2、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉。
3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。
4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測
5、專一性要求不高的定量PCR檢測。
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步
此方法適用于:
1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。
2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測。
3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。
5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對特異性要求較高的定量。
6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。