關(guān)鍵詞:侵襲小室實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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侵襲小室實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒?yàn)流程：
侵襲小室小室制備
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的**剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為*好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。
有基質(zhì)膠的Transwell小室制備
Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15－30min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。
制備細(xì)胞懸液
① 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
② 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10×105。
具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，如果*后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，因此*少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。
個(gè)人認(rèn)為，對照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對照組和處理組細(xì)胞密度一致。
接種細(xì)胞
① 取細(xì)胞懸液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細(xì)胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200μl。
② 24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。
③ 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。
通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞
① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
② 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。
優(yōu)勢：
(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。
(2). 配制簡單方便。
(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm 測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。