關(guān)鍵詞:多肽合成與修飾|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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多肽合成與修飾|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：
1） 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
2） 激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
3） 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA） 洗脫和脫保護(hù)。
試劑檢測(cè)：沒有選購(gòu)在線檢測(cè)附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測(cè)方法做基本的耦合效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
固相多肽合成中，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
用線型梯變以每分鐘 0.5% 到 1.0% 改變的速度混合。常見分析和純化用柱為 4.6× 250mm (3-10μ m) 和 22× 250mm (10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是 8×100 ( 3-10μ m )和 25× 250mm (10μ m)大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如 heptafluorobutyric 酸， 0.1% 磷酸， 稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10 -100mM NH4HCO3, 醋酸鈉 / 氨， TFA/TEA ，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn)：硅反相柱料不能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高 pH ，甚至微堿 pH ， 因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子一般多肽分離拿150mm的柱子就可以了，250mm在分離度上改善不大，因?yàn)槎嚯牡姆蛛x機(jī)理和小分子不同。小分子是通過液液交換，所以柱子越長(zhǎng)交換越充分，分離度也越高。
Asp和Glu 
Asp和Glu側(cè)鏈羧基常用t-Bu保護(hù).可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來，發(fā)展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護(hù)基可用TMSOTf(三氟甲磺酸**硅烷酯)除去.
Ser、Thr和Tyr
ser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護(hù).叔丁基的引入比較麻煩，首先ser制成芐氧羰基酯，再在酸催化下與異丁烯反應(yīng).Ser和Thr還可用芐基保護(hù)，Ser用芐醇引入芐基、Thr用溴芐引入芐基.
Asn和Gln 
Asn和Gln側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時(shí)，Asn和Gln的α-羧基活化時(shí)可能會(huì)發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)生成氰基化合物.堿性時(shí)Gln的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問題，可以用9-咕噸基，2，4，6-**氧芐基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護(hù)，這四種基因均可用TFA脫除.
His 
His是*容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護(hù).
對(duì)咪唑環(huán)的非π-N開始用芐基(Bzl)和甲基磺?；?TOS)保護(hù).但這兩種保護(hù)基均不太理想.TOS對(duì)親核試劑不穩(wěn)定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc基團(tuán)是一個(gè)較理想的保護(hù)基，降低了咪唑環(huán)的堿性，抑制了消旋，成功地進(jìn)行了一些合成.但是當(dāng)反復(fù)地用堿處理時(shí)，也表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性在堿中穩(wěn)定，但是沒能很好地抑制消旋，而且脫保護(hù)時(shí)要用很強(qiáng)的親核試劉如.
對(duì)咪唑環(huán)π-N保護(hù)，可以完全抑制消旋，π-N可以用芐氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護(hù)，(Bum)可以用TFA脫除，Bom更穩(wěn)定些，需用催化氫解或強(qiáng)酸脫保護(hù)，Bum是目前很有發(fā)展前途的His側(cè)鏈保護(hù)基，其不足之處在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差.
Cys 
Cys的-SH具有強(qiáng)親核性，易被?；闪蛎眩惨妆谎趸癁槎蜴I，必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類:一類用TFA可脫除，如對(duì)甲芐基、對(duì)甲氧芐基和三苯甲基等;**類可用(CF3CO)3T1/TFA脫除，對(duì)TFA穩(wěn)定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對(duì)弱酸穩(wěn)定，如芐基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巰基試劑和磷試劑還原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護(hù).
Arg 
Arg的胍基具有強(qiáng)親核性和堿性，必須加以保護(hù).理想的情況是三個(gè)氮都加以保護(hù)，實(shí)際上保護(hù)1或2個(gè)胍基氮原子.保護(hù)基分四類:(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.
硝基在制備、?；呀庵挟a(chǎn)生很多副反應(yīng)，應(yīng)用不廣.烷氧羰基應(yīng)主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯(lián)反效率不高，理時(shí)不處穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生副反應(yīng);Adoc保護(hù)了兩個(gè)非π-N，但有同樣的副反應(yīng)發(fā)生.對(duì)磺酰基保護(hù)，其中TOS應(yīng)用*廣，但它較難脫除.近年來2，3，6-**基-4-甲氧苯橫?；?Mtr)較受歡迎，在TFA作用下，30分鐘即可脫除，但是它們都不能完全抑制側(cè)鏈的?；l(fā)生.三苯甲基保護(hù)基可用TFA脫除.缺點(diǎn)是反應(yīng)較慢，側(cè)鏈仍有?；磻?yīng)，且其在DCM、DMF中溶解度不好.
Lys 
Lys的ε-NH2必須加以保護(hù).但與α-NH2的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽鏈合成后除去.ε-NH2的保護(hù)無消旋問題，可以采用酰基保護(hù)基，其它常用的保護(hù)基有芐氧碳基
Fmoc基團(tuán)的脫除 
Fmoc基團(tuán)的芴環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)條件很溫和.反應(yīng)過程可表示如下:進(jìn)攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二級(jí)環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物.Fmoc基團(tuán)對(duì)不同的堿穩(wěn)定性不同，可根據(jù)實(shí)際條件選用.