關(guān)鍵詞:單克隆抗體制備技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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單克隆抗體制備技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 其原理是: B淋巴細胞能夠產(chǎn)生抗體， 但在體外不能進行無限分裂; 而瘤細胞雖然可以在體外進行無限傳代， 但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細胞融合后得到的雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性。
一.提取合成專一性抗體的單個B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。
二.應(yīng)用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合，得到雜交瘤細胞。這種細胞既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性
三.對雜交瘤細胞進行細胞培養(yǎng)，選出所需要的細胞群，體外或體內(nèi)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液或動物腹水中提取單克隆抗體
單克隆抗體的提純
一般常用金黃色葡萄球菌蛋白A-瓊脂糖4B親和層析法。
單克隆抗體的保存 由腹水中獲得的抗體,經(jīng)離心去除細胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心,取上清液加0.1%NaN3，少量分裝，冷凍于-70℃可保存幾年。 但應(yīng)避免反復(fù)凍融,否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體,冷凍干燥保存于2~8℃，取出時溶解后，保存于2~8℃，至少一個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4℃)保存兩年，融化后放置4℃下保存一個月。短期使用的腹水抗體，4℃3~4 個月仍保持穩(wěn)定, 培養(yǎng)上清加0.1%NaN3，貯于-20℃，兩年不失活性。
特點:
一是特異性，針對特定的單一抗原表位，它具有高度的特異性，抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷靶細胞、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強的療效。
二是多樣性，主要表現(xiàn)在靶抗原的多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性、作用機制的多樣性等方面。
三是定向性，抗體藥物可以定向制造，就是根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體藥物。
1 骨髓瘤細胞的準備
選擇生長狀態(tài)良好的SP2/0細胞，覆蓋瓶底80％時棄上清，以不完全培養(yǎng)基洗滌一次后，用l0 mL不完全培養(yǎng)基將細胞輕輕吹下。
2 脾淋巴細胞的準備
取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫臼將小鼠致死，用75%酒精消毒體表10 min，隨即放入超凈臺內(nèi)的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；無菌打開腹腔取出脾臟，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌，并仔細去掉周圍附著的結(jié)締組織；隨后將脾臟轉(zhuǎn)移到另一個盛有DMEM的平皿中。用研磨棒擠壓，使脾細胞充分釋放，制成脾細胞懸液。
3 飼養(yǎng)細胞的制備
取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作為陰性血清，頸脫臼處死；體表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0 mL注射器，12#針頭，吸取10 mL HAT培養(yǎng)基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內(nèi)液體，注入己準備好的容器中。
4 融合
將上述制備的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于一支50 mL的帶蓋的融合管中，1000 rpm離心10 min，棄上清。將融合管置于手掌中，輕輕摩擦底部，使兩種細胞充分混勻；在37°C水浴中45 s內(nèi)緩慢加入1 mL預(yù)熱的PEG-1500到融合管中，邊加邊輕輕搖勻；隨即在90 s內(nèi)先慢后快滴加30 mL 37°C預(yù)熱的不完全DMEM培養(yǎng)基，使PEG稀釋而失去作用，37°C靜置10 min，1000 rpm離心10 min；棄上清，用60 mL HAT培養(yǎng)基輕輕懸浮沉淀細胞，再加入適量的腹腔巨噬細胞；分裝于96孔細胞培養(yǎng)板，然后將培養(yǎng)板置37°C 6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5 d后用新鮮的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基；10 d后用預(yù)熱的HT換出HAT；觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其細胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取適量細胞上清進行ELISA檢測,兩次檢測結(jié)果為陽性設(shè)為陽性克隆孔。
雜交瘤細胞的克隆化及建株
采用有限稀釋法對連續(xù)兩次檢測為陽性的細胞株進行克隆化。陽性細胞計數(shù)，取100個細胞放入5 mL含飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液中，即20個細胞/mL，100 μL/孔滴加于96孔細胞培養(yǎng)板，即每孔1個細胞：再將余下的細胞懸液倍比稀釋，細胞數(shù)為10 個/mL，100 μL /孔滴加于96孔細胞培養(yǎng)板，即每孔0.5個細胞。第8～9 d時，肉眼可見細胞克隆，對出現(xiàn)單個細胞克隆的孔再按篩選陽性雜交瘤細胞的間接ELISA方法進行篩選。連續(xù)進行三次以上亞克隆，判為陽性的細胞株擴大培養(yǎng)，建株凍存。