關(guān)鍵詞:SRB技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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SRB技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 1.SRB檢測方法的原理
磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合;在540 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的定量檢測。SRB染色后不會像MTT法那樣很容易變色，細胞固定染色后在96孔板中可以放置較長時間，因而受測定時間的影響較小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可穩(wěn)定較長時間。因此不同時間點固定的96孔細胞培養(yǎng)板可在同一時間測定，測定的吸光值結(jié)果不會受到明顯影響。吸光值與SRB濃度作圖時，在OD單位1.5-2.0以下為線性，當(dāng)超出線形范圍時，*好稀釋后重新讀數(shù)。雖然SRB法比其他檢測方法操作步驟繁瑣，但是由于時間可以自己掌握，不受限制，因此適用于高通量篩選。
2.SRB檢測的操作步驟
1)細胞固定:藥物作用時間終點時，每孔加入50μL4℃預(yù)冷的TCA溶液(30%，w/v)固定細胞，TCA溶液的終濃度為10%。靜置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。
2)染色:待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。
3)檢測:用100μL非緩沖Tris-base堿液(10mM，pH=10.5)溶解與細胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20min，采用酶標(biāo)儀540nm處測定光吸收值。操作中，應(yīng)注意洗除染料時操作需迅速，避免用移液器吸取液體，防止動作過慢造成與細胞蛋白結(jié)合的染料解吸附。
3.SRB檢測的計算公式
根據(jù)美國國立癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)關(guān)于SRB檢測的介紹，細胞增殖百分率的計算存在以下兩種情況:1)Tx-T0>0，PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)
2)Tx-T0<0，PG=100×(Tx-T0)/T0
其中，
T0:藥物作用前的細胞經(jīng)過固定、染色后測得平均吸光值;
C:培養(yǎng)基中加有等體積的DMSO，沒有藥物作用的陰性對照的平均吸光值(陰性對照);
Tx:藥物作用終點時細胞經(jīng)過固定、染色后測得平均吸光值。
PG即Percentage Growth，是指藥物作用的樣品孔與陰性對照孔中細胞增殖量的百分率。
1， 根據(jù)水樣中 SRB 的估計濃度，可以選擇一組合適數(shù)目的細菌瓶。首先將培養(yǎng)瓶排成 一組，并依次編上序號。 
2， 將細菌瓶的瓶塞保護膜揭去，并用 70%的乙醇溶液消毒。 
3， 按照準備工作的第 3 條操作后，用無菌注射器取 1ml 水樣，注入到一號瓶內(nèi)，充分 震蕩。 
4， 用另一支無菌注射器從一號瓶內(nèi)取 1ml 水樣，注入到二號瓶內(nèi)，充分震蕩。 
5， 再更換一支無菌注射器，從二號瓶內(nèi)取 1ml 水樣，注入到三號瓶內(nèi)，充分震蕩。 
6， 依次類推，一直稀釋到*后一瓶為止。根據(jù)細菌含量確定稀釋瓶數(shù)，一般稀釋到 7 號瓶。 
7， 把上述測試瓶放入到恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)溫度控制在現(xiàn)場水溫正負 1℃范圍內(nèi)，兩周 后讀數(shù)。 
實驗?zāi)康模簷z測細胞增殖活力或檢測樣品對細胞體外增殖的影響
實驗原理：磺酰羅丹明是一種能與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合的水溶性蛋白染料，其結(jié)合于細胞中的量的多少可以反映總蛋白量進而反映細胞數(shù)的多少。在515nm波長處的OD值與活細胞數(shù)呈良好的線性
關(guān)系。
實驗材料： SRB（SIGMA），其它同MMT法
實驗內(nèi)容與方法：
1.  細胞計數(shù)、稀釋細胞懸液，接種96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)；
2.  加入含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性、溶媒及陽性對照組，培養(yǎng)；
3.  SRB染色，測定；
4.  計數(shù)各組別抑制率及應(yīng)用SPSS 17.0通過Bliss法計算IC50.