關鍵字：A-375細胞
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免疫組化操作步驟 
(酶聯免疫吸附試驗：A-375細胞
  方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 
1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。 
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。   
3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。   
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。  
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 
方法二 用于檢測未知抗體的間接法： 
 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，   每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。  
 ↓   加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔   中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）  
 ↓   于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標**抗體（抗抗體）0.1ml，   37℃孵育30-60分鐘，洗滌,*后一遍用DDW洗滌。  
 ↓   其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 
 試劑器材 A-375細胞
  1. 試劑   （1） 包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:   NaHCO3 1.59克   NaHCO3 2.93克   加蒸餾水至1000ml 
 （2） 洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M   KH2PO4 0.2克   Na2HPO4·12H2O 2.9克   NaCl 8.0克   KCl 0.2克   Tween-20 0.05％ 0.5ml   加蒸餾水至1000ml   
 （3） 稀釋液：   牛血清白蛋白（BSA） 0.1克   加洗滌緩沖液至100ml   或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使
 （4） 終止液（2M H2SO4）：   蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。  
 （5） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:   0.2MNa2HPO4（28.4克／L）25.7ml   0.1M檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml   加蒸餾水50ml。
 （6） TMB（四甲基聯苯胺）使用液:   TMB（10mg／5ml無水乙醇）0.5ml   底物緩沖液（PH5.5） 10ml   0.75％H2O2 32μl   
 （7） ABTS使用液:   ABTS 0.5mg   底物緩沖液（PH5.5） 1ml   3％H2O2 2μl  
 （8） 抗原、抗體和酶標記抗體。 
 （9） 正常人血清和陽性對照血清。 
  2. 器材:  
 （1） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。   
 （2） 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。   
 （3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。A-375細胞
影響Elisa試驗結果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質量保證才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點、Elisa試劑盒測定技術的發(fā)展  臨床測定技術的發(fā)展主要在于方法學的發(fā)展，
而方法學的發(fā)展依托于試劑生產技術不斷進步更新和型標記物的應用。目前，分子生物學正在并*終肯定會讓我們對整個生命科學有一個**而徹底的認識，
其對免疫測定技術發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對以前一些難以檢測的生物活性物質的測定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。
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