一、實驗目的 
  熟悉植物培養(yǎng)基的基本成分及其作用，掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法及操作要求，掌握培養(yǎng)基與接種用品的滅菌原理及高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。
  通過月季等園林植物的組培操作，了解植物組織培養(yǎng)的基本原理和一般方法，及其在園林植物育種中的應用。
二、實驗原理 
  培養(yǎng)基主要為離體培養(yǎng)植物材料的生長提供營養(yǎng)物質和生長調劑物質，通常分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基兩個水平。前者包括大量元素（無機營養(yǎng)元素）、微量元素、有機附加物（維生素、氨基酸等）、糖和水，固體培養(yǎng)基還需加入凝固劑如瓊脂；完全培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)不同的試驗材料和目的，添加一定濃度的生長調節(jié)劑如 BA 、 NAA 等以及成分復雜的有機附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的 pH 值。不同種植物的離體培養(yǎng)，甚至同種植物不同器官或組織的培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求可能有些不同。園林植物離體培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。
  瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質，是應用*廣的凝固劑。加入瓊脂制成的培養(yǎng)基在 98 ～ 100 ℃下融化，于 45 ℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性會降低。
  植物培養(yǎng)基含有豐富而**的營養(yǎng)物質，能供養(yǎng)很多細菌、真菌等微生物的生長。因此，任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成便需及時徹底滅菌，以備培養(yǎng)之用；接種時使用的所有用品如濾紙、水等也要進行滅菌。一般采用高壓蒸汽滅菌，于高壓滅菌鍋內進行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 ℃的條件下消毒 20 ～ 25min 。
  研究表明，植物的細胞具有全能性，即在一定的培養(yǎng)基（包括營養(yǎng)成分、激素等）和培養(yǎng)條件下可再生出完整的植株。通過合適的激素配比和培養(yǎng)條件可調控植物細胞的分裂和分化，改善植物的分化和繁殖能力。
三、主要儀器及試材 
1 ．儀器用具
  電子天平、稱量紙、牛角匙、精密 pH 試紙、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、玻璃棒、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、封口膜、電爐或微波爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、超凈工作臺、鑷子、手術刀、無菌濾紙、酒精燈、培養(yǎng)箱（室）等。
2 ．藥品試劑
  大量元素（ NH 4 NO 3 、 KNO 3 、 MgSO 4 ·7H 2 O 、 KH 2 PO 4 、 CaCl 2 ·2H 2 O ）、微量元素（ KI 、 H 3 BO 3 、 MnSO 4 ·4H 2 O 、 ZnSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 CuSO 4 ·5H 2 O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有機成分（肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸）、 FeSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 EDTA·2H 2 O 、 瓊脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、 BA 、 NAA 等。
  培養(yǎng)基（包括大量元素、微量元素、有機成分、植物激素等）、無菌水、脫脂棉、 95 ％酒精、雙氧水、蒸餾水等。

四、實驗方法與步驟 
  1 ． 培養(yǎng)基母液的配制 —— 以 MS 培養(yǎng)基為例 
  MS 培養(yǎng)基含有近 20 種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這些成分單獨進行稱量，可將培養(yǎng)基中的各類成分，分別按原用量的 20 倍或 200 倍配成濃縮液，即培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時，取其總量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培養(yǎng)液（基）。
  1 ）大量元素母液（ 20 ×）：分別稱取 33g NH 4 NO 3 、 38g KNO 3 、 7.4g MgSO 4 ·7H 2 O 和 3.4g KH 2 PO 4 ，裝入 500ml 燒杯中，加入適量蒸餾水將其充分溶解；另稱取 8.8g CaCl 2 ·2H 2 O ，單獨溶于 200ml 蒸餾水。然后將二者混合，定容至 1 L ，充分混勻后于 4 ℃條件下貯存?zhèn)溆茫ㄏ峦?br>  2 ）微量元素母液（ 200 ×）：分別稱取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO  
  3 、 166mg KI 、 50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 5mg CuSO 4 ·5H 2 O 、 5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸餾水溶解后，定容至 1L 。
  3 ）有機成分母液（ 200 ×）：分別稱取 10g 肌醇、 50mg 煙酸、 50mg 鹽酸吡哆醇、 50mg 鹽酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。
  4 ）鐵鹽母液（ 200 ×）：稱取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2 EDTA·2H 2 O ，分別溶于 450ml 蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解，然后將兩種溶液混合，于 80 ℃水浴中充分熬合（ 30min ），*后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。
  生長調節(jié)劑母液：稱取 50mg 或 100mg 植物生長調節(jié)劑（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生長素類先用少量酒精溶解，細胞分裂素類先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸餾水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。
  2 ． 培養(yǎng)基的配制 
  以配制 1 L MS ＋ BA 1.0mg/L ＋ NAA 0.5mg/L 固體培養(yǎng)基為例，基本操作過程如下：
  1 ）稱取 30g 蔗糖和 7g 瓊脂，裝入 1 L 的容器（如燒杯）中，加入約 700ml 蒸餾水，置于帶石棉網(wǎng)的電爐上或微波爐中加熱，并用玻棒攪拌，至瓊脂完全溶化。
  2 ）用量筒或移液管分別取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有機成分母液和 5ml 鐵鹽母液，加入上述容器中。
  3 ）分別用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培養(yǎng)基中，然后加蒸餾水將總體積定到 1000ml 。
  4 ）以 0.5M NaOH 溶液將培養(yǎng)基的 pH 調至 5.8 ～ 6.0 ，混勻后分裝于培養(yǎng)容器中，每瓶裝入約 30ml 培養(yǎng)基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，配制好的培養(yǎng)基可先裝入三角瓶，滅菌后（培養(yǎng)皿同時滅菌）于超凈工作臺上進行分裝。
  3 ．滅菌 
  將培養(yǎng)基、無菌水、濾紙、器皿等放入高壓滅菌鍋內，于 1.01kg/cm 2 壓力、 121 ℃條件下滅菌 20min 。滅菌完畢后，將培養(yǎng)基取出（其他滅菌材料一并取出），水平放置于實驗臺上，待其冷卻凝固后便可用于接種培養(yǎng)。
  具體操作按滅菌鍋的說明書進行，包括加水、裝鍋、蓋蓋、加熱、排放冷空氣、升壓保溫、降壓排氣、出鍋冷卻等步驟。
  徹底滅菌后的培養(yǎng)基可于實驗室內保存一段時間，但*好盡快使用。
  4． 接種材料（外植體）的消毒： 將帶腋芽的枝條剝去枝條上的葉片，先以自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺上以 70% 的酒精和 0.1% 升汞溶液進行表面消毒，無菌水漂洗 3 ～ 5 次。然后在無菌條件下將帶芽的枝條切成芽段（每段帶有一個腋芽），用于接種。試管苗不需經(jīng)過消毒可直接將其切成芽段進行接種。
  5 ．接種： 將外植體材料接種到已滅菌的培養(yǎng)基中。
  6 ．培養(yǎng)： 將接種好的材料置于培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度 25 ± 1 ℃，光照強度 1000 ～ 1200 lux ，光照時間 12 h/d 。
  7 ．繼代增殖： 將萌發(fā)后的嫩芽切下，接種于繼代培養(yǎng)基上，調整培養(yǎng)基中附加激素的比例，可獲得大量的叢生芽。
  8 ．生根培養(yǎng) ：將長到一定高度的芽切下，接種到生根培養(yǎng)基中，誘導生根后移植。
  9 ．試管苗的移栽 ：將誘導發(fā)根后的月季試管苗從培養(yǎng)瓶中輕輕取出，洗凈根部培養(yǎng)基。植株上部只保留 3 ～ 4 片葉，其余的葉剪去，將其細心地移入準備好的小盆中。浸透水后置于塑料棚內。棚內空氣濕度保持在 85 ％以上，溫度 10 ～ 20 ℃左右。一周后慢慢揭膜練苗，半月后將薄膜全部揭開，并噴施稀薄營養(yǎng)液，使小苗得到營養(yǎng)補充。
五、實驗注意事項 
  1 ．配制培養(yǎng)基母液的濃度應根據(jù)實際使用情況確定，*好能使母液在 1 ～ 2 個月內用完，其中有機成分要在 4 ℃冰箱內保存。大量元素母液的配制過程中， CaCl 2 必須單獨溶解，然后再與其他成分的溶液混合，否則溶液中易出現(xiàn)沉淀；配制鐵鹽母液時，兩種成分應單獨溶解后再于 80 ℃左右充分熬合，避免發(fā)生結晶沉淀。
  2 ．配制培養(yǎng)基的所用器皿和用具均應洗滌干凈，培養(yǎng)基的 pH 值應調整準確，滅菌時間不宜過長，否則培養(yǎng)基可能會出現(xiàn)不凝固現(xiàn)象。
  3 ．培養(yǎng)基配制后應及時進行滅菌，如因特殊情況不能及時滅菌，*好放入冰箱內暫存。
  4 ．高壓滅菌鍋的使用應嚴格按照說明書進行操作，尤其注意檢查鍋內水位，防治干燒導致電熱管損壞。
六、實驗結果處理 
  １． 5 ～ 6 人為一組，每組按要求配制一種培養(yǎng)基，分裝滅菌。
  ２．記錄培養(yǎng)基配制與滅菌的一般程序和注意事項。
  3．所有的實驗用具均需嚴格洗凈，和培養(yǎng)基一起滅菌后使用。
  4．接種的整個過程都需在無菌條件下進行，不得違章操作。
七、思考題 
  １． MS 培養(yǎng)基的主要成分有哪些？在植物材料的離體培養(yǎng)中各起什么作用？
  ２．如何保證滅菌后培養(yǎng)基能正常凝固？
  3．植物組織培養(yǎng)的原理是什么？
  4．談談植物組織培養(yǎng)在園林植物育種中的應用價值。