關(guān)鍵詞:細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 一、細(xì)胞傳代
1. 試驗準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次
3. 用tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。
4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
5. 用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
7. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后選擇0.8X106個細(xì)胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。
8. 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，**天轉(zhuǎn)染。
二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
三、**次細(xì)胞傳代
1. 在轉(zhuǎn)染后24小時，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
2. 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞實驗方法
1、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時，將貼壁細(xì)胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×10^5/孔左右。
2、**天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。
3、(對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。
4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。
5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時后可見明顯熒光表達(dá)，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。
1.  在6孔板中接種1~3×105細(xì)胞/孔，加入2ml完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。
2.  待細(xì)胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：
i.  溶液A：將4?g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min
ii.  溶液B：將2-25?l LipofectAMINE 稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min
3.  混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。
4.  用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。
5.  用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。
6.  24-72hr后檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達(dá)株。