關(guān)鍵詞:探針合成技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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探針合成技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 1、  合成cDNA步驟
（1）    加入從卵巢癌細(xì)胞或組織中提取的總RNA ≥ 5ug。
（2）    加入 Nuclease-free 水 75 ul
（3）    加入 5x iScript Reaction Mix，按20 ul/ 100ul 比例加入。
（4）    加入 iScript RT，5 ul.
（5）    在pcr儀上，按以下步驟進(jìn)行加熱：
5 minutes at 25°C；30 minutes at 42°C；5 minutes at 85°C。
儲存在 –20C冰箱。
2、  擴(kuò)增ERCC2目的片段
（1）   訂購ERCC2引物，序列如下：
F：5'-CCGctcgagGCTCCTGGTCTACTTCCCGTACG-3'
R：5'-ATTTgcggccGCACGCAGCCGCCACTTCACGTAC-3'
（2）   準(zhǔn)備反應(yīng)液：
按以下試劑比例進(jìn)行反應(yīng)MIX的配置：
10x reaction buffer                            5 ul (1x)
dNTPs (stock 10 mM)                            1.0 ul (200uM
Forward primer (250uM)                        1.0 ul (0.2 uM)
Reverse primer (250 uM)                     1.0 ul ( 0.2 uM)
cDNA template                             1 ul  (1 ug)
Taq PCR Polymerase enzyme                  0.5 ul
ddH20                                        up to     50 ul
Total                                                50 ul
（3）   PCR 反應(yīng)過程
1)        準(zhǔn)備PCR儀，并檢查是否可用。
2)        打開PCR儀頂蓋，將96PCR板放置在加熱模塊上蓋緊頂蓋；
3)        選擇程序如下：
1cycle：94’C，3 min  
35 cycles： 94’C，30s；62’C，1 min；72’C，1.5 min             
1cycle：72’C，7 min；4’C    forever
（4）   配制瓊脂糖凝膠：
1)   取出干燥的鋪膠板。
2)   稱取2.5g 的瓊脂糖，放入250ml 的容量瓶中，用量筒量取250ml 的1x TAE 加入容量瓶中，輕輕搖晃2－3 下。
3)   將盛有TAE 和瓊脂糖的容量瓶放入微波爐中，高火加熱4min。
4)   小心取出，室溫冷卻5－10min，稍微搖晃混勻，待溶液溫度冷卻到60℃（不燙手為宜），混勻。
5)   將瓊脂糖溶液倒入事先準(zhǔn)備膠槽中，將梳子放置在膠槽上，室溫避光放置30min 左右。
6)   待凝膠干燥后備用。
（5）   瓊脂糖凝膠電泳：
1)   準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物。
2)   取出酶標(biāo)板,吸取1ul 6x loading buffer，加入酶標(biāo)板孔底，加入5ul PCR 產(chǎn)物與loading buffer混勻。
3)   將8道移液器調(diào)至6ul，吸取樣本點樣電泳，原則是從右向左，從下向上，140v，電泳20min 左右。
4)   將電源斷開，取出瓊脂糖凝膠，放入盛有EB的容器中，泡10min。
5)   將浸泡過的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)照相，保存膠圖。