關(guān)鍵詞:免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 材料
1，  蛋白A 或蛋白G
2，  一抗
3，  免疫沉淀緩沖液：20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% 疊氮化鈉.
（> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%疊氮化鈉 也可作為免疫沉淀的緩沖液，能提高蛋白G的結(jié)合功效）
4，  洗脫液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5，  SDS-PAGE 上樣緩沖液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5% 
實驗流程為：
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以*大速度離心15 min。
3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。*后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。
7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳。
8．通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。
11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進(jìn)行自動Edman降解測序。
在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性，應(yīng)注意以下幾點：
(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
(2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；
(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。