關(guān)鍵詞:密碼子優(yōu)化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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密碼子優(yōu)化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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測序?qū)嶒?yàn)流程：
功能蛋白的外源宿主表達(dá)是現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)，然而很多蛋白由于可能包含有抑制表達(dá)的因子：如有機(jī)體使用了不常用的密碼子等，在外源宿主中很難表達(dá)。日益發(fā)展的基因設(shè)計(jì)與合成技術(shù)使通過基因設(shè)計(jì)改善蛋白表達(dá)成為可能，例如，可以通過基因設(shè)計(jì)使基因與宿主的密碼子使用頻率相匹配來提高蛋白表達(dá)水平。金斯瑞基因設(shè)計(jì)不僅包括密碼子優(yōu)化，還包括mRNA結(jié)構(gòu)修正、翻譯起始位點(diǎn)的優(yōu)化等。
密碼子偏愛與蛋白表達(dá)
密碼子偏愛性在原核基因表達(dá)中已經(jīng)被證實(shí)是一個(gè)很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之間，蛋白的表達(dá)水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細(xì)胞內(nèi)可用的tRNAs量的差異。因此優(yōu)化翻譯系統(tǒng)*佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應(yīng)的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會(huì)影響基因的表達(dá)。
將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子
通常基因中包含的密碼子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達(dá)量也就越少，甚至當(dāng)這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時(shí)候表達(dá)量會(huì)更少。在不改變氨基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達(dá)水平。
去除問題密碼子
任何來源的密碼子如果在宿主生物體內(nèi)的利用率低于5%到10%時(shí), 就會(huì)出現(xiàn)表達(dá)抑制，當(dāng)這些低利用率密碼子臨近或相連時(shí), 對蛋白表達(dá)的影響更大。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號(hào)的密碼子能夠防止低表達(dá)或者不表達(dá)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)病毒蛋白
病毒基因經(jīng)過合適的處理也能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞成功表達(dá)，病毒基因密集的信息常常引起閱讀框重疊，許多病毒基因能夠逆序編碼。病毒基因不僅表達(dá)目的蛋白也表達(dá)調(diào)控元件，因此能夠平均提高蛋白表達(dá)量達(dá)28%。通過對病毒密碼子進(jìn)行優(yōu)化以增加靶點(diǎn)免疫原性對于DNA疫苗的研究非常重要。
其他影響因素
雖然密碼子偏愛在基因表達(dá)中起著重要的作用，但表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達(dá)對于低利用率密碼子和接近起始位點(diǎn)的密碼子AUG非常敏感。翻譯與mRNA的穩(wěn)定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會(huì)使mRNA由于缺少了核糖體的保護(hù)而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。穩(wěn)定mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和接近5'端的分子也對基因表達(dá)有重要的影響。利用翻譯時(shí)目的基因上游的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達(dá)效率。
【目的】利用密碼子優(yōu)化技術(shù),提高甘油脫氫酶基因gldA在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
【方法】針對gldA起始密碼子下游區(qū)域,優(yōu)先選擇AT含量*高的同義密碼子,從而在不改變氨基酸序列的前提下,提高該區(qū)域的AT含量。利用大引物PCR的方法對野生型gldA-WT進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得優(yōu)化型基因gldA-4,與pET-32a（＋）連接后,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-gldA-4,轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）,得到工程菌E.coli-4。同時(shí),設(shè)定包含gldA-WT的工程菌E.coli-WT作為對照,搖瓶發(fā)酵后,以甘油為底物檢測比較表達(dá)產(chǎn)物的酶活力。
【結(jié)果】gldA-4相對gldA-WT而言,改變了第2、5、6位密碼子中的4個(gè)堿基,AT含量從53.3%提高到80.0%。相應(yīng)地,E.coli-4的粗酶液的酶活力為191.3 U/mL,比E.coli-WT的48.3 U/mL提高了3倍多。