關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測(cè)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因甲基化檢測(cè)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
DNA甲基化是*早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
檢測(cè)程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化;反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，*后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱(chēng)為BSP-直接測(cè)序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱(chēng)為BSP-克隆測(cè)序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化.
送樣要求
細(xì)胞(≥106 個(gè))、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點(diǎn)與程度的實(shí)驗(yàn)方法有三類(lèi)：
（1）（M SREs）利用對(duì)甲基化堿基敏感的限制性?xún)?nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點(diǎn)，從而產(chǎn)生片段差異，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點(diǎn)與甲基化程度，
（2）另一類(lèi)是利用將沒(méi)有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì)，而甲基化的C不會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化來(lái)識(shí)別甲基化位點(diǎn)。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過(guò)合成方法進(jìn)行序列分析的方法，它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測(cè)，以及細(xì)菌和病毒的鑒定和分型研究。這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來(lái)自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)峰值的高度可以**的檢測(cè)混合DNA模板中等位基因的頻率，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和**性。