關(guān)鍵詞:核酸提取與純化|實驗技術(shù)服務(wù)
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核酸提取與純化|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 1.核酸的提取
核酸都溶于水，而不溶于有機溶劑，利用此性質(zhì)進行提取。在細胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白（DNP），RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白（RNP），在不同濃度的鹽溶液中它們的溶解度差別很大，DNP在純水或1 mol/LNaCl溶液中溶解度較大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0.14mol/LNaCl溶液可簡單地初步分開DNP和RNP。
在分離核酸中*困難的是將核酸與緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，而且還要避免核酸的降解。常用的解離劑是陰離子去垢劑，如脫氧膽酸鈉，十二烷基硫酸鈉（SDS），４－氨基水楊酸鈉和萘－1，5－二磺酸鈉等，它們具有溶解病毒、細菌的作用，可使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來，還具有抑制核糖核酸酶的作用。另外除去核酸中的蛋白質(zhì)的一個有效辦法是用酚－氯仿混合液，它們可使蛋白質(zhì)變性，并對核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有機相和水相完全分開，減少殘留在水相中的酚。在用酚－氯仿抽提核酸提取液時，還須要劇烈振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，在酚－氯仿抽提液中再加上一定量的異戊醇。
2. 核酸的純化
核酸的純化*關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用酚／氯仿、氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當(dāng)需要把DNA克隆操作的某一步所用的酶滅活或去除以便進行下一步時，可進行這種抽提。然而，如果從細胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶Ｋ等，它們對多數(shù)天然蛋白質(zhì)均有活性。
用酚／氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用，比單獨用酚抽提除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。具體步驟如下：
①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚／氯仿；②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀；③12000ｇ室溫離心15ｓ；④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相；⑤重復(fù)步驟①～④，直至兩相界面上無蛋白質(zhì)為止；⑥加入等體積的氯仿并重復(fù)②～④步操作；⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
3.核酸的濃縮
應(yīng)用*廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成的核酸沉淀可經(jīng)離心而回收。甚至對低至ｐｇ（皮克）量的DNA或RNA，也可定量回收?；厥盏暮怂峥砂此铦舛龋偃苡谶m當(dāng)?shù)木彌_液中。具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入單價陽離子鹽貯存液。單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時該去垢劑在70％乙醇中仍保持可溶。
DNA和RNA的沉淀，大多使用醋酸鈉（pＨ5.2）。
產(chǎn)品組成:
集液管
核酸純化柱的集液管由醫(yī)療級的聚丙烯制成，容量為2ml和50ml。
Column
核酸純化柱的column由醫(yī)療級的聚丙烯制成，底部為網(wǎng)狀或帶接口，容量約為1ml或25ml。
墊片
核酸純化柱的墊片為特殊纖維材料，耐受酸堿和大部分的有機溶劑，對大部分的生物分子不會產(chǎn)生吸附。
濾膜
經(jīng)過特別優(yōu)化的進口原料的硅膠膜或者玻璃纖維膜，*大程度的吸附核酸分子。