關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)純化技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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蛋白質(zhì)純化技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。
(1) 根據(jù)分子大小不同的分離方法:透析和超過濾(利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì));密度梯度離心(蛋白質(zhì)在介質(zhì)中離心時質(zhì)量和密度較大的顆粒沉降較快);凝膠過濾(一種柱層析)
(2) 利用溶解度差別分離:(等電點沉淀法)由于蛋白質(zhì)分子在等電點時凈電荷為零，減少了分子間靜電斥力，因而容易聚集沉淀，此時溶解度*小);鹽溶與鹽析(利用一定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質(zhì)的溶解度)
(3) 根據(jù)電荷不同的分離方法，主要包括電泳和離子交換層析分離;
(4) 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離(利用顆粒吸附力的強弱不同達到分離目的)
(5) 根據(jù)配體特性的分離--親和層析(利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異而非共價地結(jié)合這一生物性質(zhì))
(6) 低溫有機溶劑沉淀法: 用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行。
注意事項:
在進行任何一種蛋白質(zhì)純化的時候，都要時刻注意維護它的穩(wěn)定性，保護它的活性，有一些通用的注意事項需要牢記，它們包括:
1、操作盡可能置于冰上或者在冷庫內(nèi)進行。
2、不要太稀，蛋白濃度維持在μg/mL~mg/mL。
3、合適的pH，除非是進行聚焦層析，所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同，防止蛋白質(zhì)的沉淀。
4、使用蛋白酶抑制劑，防止蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解;在純化細胞中的蛋白質(zhì)時，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA對蛋白的污染。
5、避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動，以防蛋白質(zhì)的變性。
6、緩沖溶液成分盡量模擬細胞內(nèi)環(huán)境。
7、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇)，防止蛋白質(zhì)的氧化。
8、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑，防止重金屬對目標(biāo)蛋白的破壞。
9、使用滅菌溶液，防止微生物生長。
一、電泳:
在克隆基因表達產(chǎn)物的檢測分析過程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時，通常都不采用電泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化蛋白質(zhì)，常用下述方法進行:①從電泳后的凝膠上切下所需的相應(yīng)條帶，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡，使其中的蛋白質(zhì)擴散出來，從而獲得純化的蛋白質(zhì)。此法簡單但回收率低。②將電泳后的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到溶液中，從而達到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。
二、色譜法:
色譜法(chromatography)是蛋白純化中*常用的一種方法，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質(zhì)，又可以保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。色譜的種類很多，可分為常規(guī)色譜和高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)。凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規(guī)色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜(reversed-phase HPLC,RP-HPLC)、離子交換高效液相色譜(ion exchange HPLC)等。根據(jù)目標(biāo)蛋白性質(zhì)的不同可選用相應(yīng)的色譜分離技術(shù)純化蛋白質(zhì)。
1.凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法(gel-filtration chromatography, GFC)又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀顆粒物質(zhì)，如瓊脂糖凝膠(sepharose)、葡聚糖凝膠(sephadex)，將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用于物質(zhì)的分離。
GFC可在存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強度、常溫或低溫等多種條件下進行，根據(jù)所分離物質(zhì)的性質(zhì)不同可選擇相應(yīng)的色譜條件，從而獲得有生物學(xué)活性的純化的生物大分子。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的不同進行分離的技術(shù)，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等復(fù)雜的物理化學(xué)過程。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用于帶正電荷物質(zhì)的分離，而陽離子交換劑可用于帶負電荷物質(zhì)的分離。
3.親和色譜
親和色譜法可在溫和條件下操作，純化過程簡單、快速、分辨率高，對分離含量極少且性質(zhì)不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效。但由于不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對于某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應(yīng)用具有一定的局限性，主要由于蛋白質(zhì)尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。